医麦客|利用CRISPR技术原位表达外源TCR，这款T细胞疗法具有多重优势丨医麦黑科技

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2020年6月8日/医麦客新闻 eMedClub News/--在多年的发展史中，非工程化的T细胞过继转移疗法（例如供体淋巴细胞输注）以卓越的安全性和有希望的疗效给一些疾病带来了新的治疗选择，但是其限制因素也很明显，就是很难匹配到合适的供体。
为了解决这个问题，科研人员开发了工程化的T细胞疗法（例如CAR-T细胞），从患者自身的免疫细胞出发，不再需要寻找合适的供体，但是同样的，这些工程化T细胞疗法的制造问题和随后的毒副作用管理限制了其发展。
目前CAR-T产品已经证实了CAR-T细胞对于血液系统恶性肿瘤的潜力，但是在实体瘤领域， CAR-T疗法还存在一定的挑战。在治疗实体瘤方面方面，被普遍认为的是TCR疗法可能比CAR疗法更具优势。

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TCR-T疗法以及一些工程问题
而相比于CAR-T细胞疗法， TCR-T同样是对患者自身的T淋巴细胞进行体外改造，然后将其回输到患者体内杀伤肿瘤的细胞疗法，但这两种疗法识别抗原的机制截然不同。

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▲ TCR-T与CAR-T细胞疗法（图片来源：Kite）目前，两款上市的CAR-T产品都只靶向癌细胞表面的一种蛋白质（CD19），只能识别位于细胞表面的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原，这样的作用方式更直接，不需要抗原呈递的过程。但同时，这也决定了CAR-T疗法更适合表面抗原暴露程度更高的血液肿瘤；不能有效浸润到肿瘤内部，是导致目前实体瘤上疗效不佳的原因之一。此外， CAR-T引入的则是一个由科学家重新设计靶向肿瘤的CAR抗体，已知有可能导致严重的副作用(如细胞因子风暴) 。 TCR-T引入的是T细胞抗原受体(TCR) ，通过提高TCR的活性，来增强对癌细胞的杀伤力。 TCR-T不仅能识别位于细胞表面的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原，还能识别细胞内的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原，这使其在治疗实体瘤方面具有优势。此外， TCR还能靶向源自突变的肿瘤新生抗原，肿瘤新生抗原对肿瘤本身具有非常特异性的优势，减轻了脱靶识别的危险。

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TCR-T
免疫细胞疗法
尽管TCR-T疗法具有巨大的潜力和优势，但是TCR工程改造存在一定的问题。常规来说， T细胞通过病毒转导来装备TCR ，而这种传统的工程方式会带来一些问题。首先， T细胞内源性的TCR仍然存在，抑制了表面表达和产生错配假体TCR ，导致转基因TCR功能的下降，有可能导致自身反应或/和移植物抗宿主病（GVHD）。幸运的是，迄今为止，尚未在任何临床环境中观察到该不良事件。但是在行业内已经存在较为普遍的共识，需要更谨慎小心的处理。其次，病毒转导会导致转基因随机整合，非病毒转导例如“睡美人” 转座系统也会存在至少半随机基因整合，带来安全性问题。这也使得需要外源性基因启动子来保证未知基因位点的转基因表达。相比于非工程化的T细胞在抗原接触后TCR会下调， TCR转染的T细胞几乎没有下调，说明工程转基因调控可能源于外源启动子驱动转基因TCR表达。面对这些问题，德国的一个研究团队提出转基因TCR靶向插入的新策略。该团队新发表的论文 Orthotopic T-Cell Receptor Replacement—An “Enabler” for TCR-Based Therapies 中，提出利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR-Cas9 ，将转基因TCR直接替换原位T细胞受体（Orthotopic T-Cell Receptor ， OTR），就可以解决以上所有问题。分页标题

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OTR-T疗法的可行性
抗原特异性T细胞疗法在多年的临床中证实了其治疗价值，随着CRISPR-Cas9等基因编辑工具的出现，为开发更多的细胞疗法带来了可能。在该研究中，研究人员设计的同源性定向修复(HDR)方案是：利用CRISPR/CRISPR-Cas9将完整的αβTCR整合到T细胞受体α恒定(TRAC)基因位点，同时编辑T细胞受体β恒定(TRBC)基因位点，非同源末端连接导致内源TCRβ链的敲除；2A元件的切割导致转基因TCR链在细胞内的表达、内源性TCR的缺失。因此细胞表面仅表达了转基因的αβTCR 。

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▲ 同源性定向修复(HDR)方案（图片来源：mdpi）
论文中，研究人员表示TCR靶向插入不仅仅只是将抗原受体插入到所需的基因位点，而且可以对转基因拷贝和表达水平进行严格的控制，转基因拷贝数是一个关键的安全参数， TCR表达水平对T细胞功能有显著影响。
相比利用病毒转导的TCR/CAR-T疗法，利用OTR方法工程化的T细胞的TCR/CAR表达更加明确，且OTR方法能够预测细胞产品的潜力。
总而言之， OTR-T细胞比传统的TCR-T细胞更为安全，且拥有预测疗效的潜力；此外OTR还能使工程化的T细胞产品更加精简，拥有更直接的生产过程。
但是仍然存在一定的顾虑， OTR方法发生在一个TCR基因座两个等位基因上，双等位基因的插入是否会有脱靶的可能、等位基因特异性TCR如何进行调控，当然还有更多的挑战，而这在接下里的进一步研究中都亟待解决。
此外，研究人员还将OTR-T细胞疗法与多种基于T细胞的免疫疗法（免疫点检查抑制剂、非工程化T细胞疗法、CAR/TCR-T细胞疗法）进行了对比，详细分析了OTR-T细胞疗法的优势与挑战。（如下图）

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▲ 绿色（有利）黄色（中等）红色（不利）灰色（未知）（图片来源：mdpi ）
鉴于其新颖性， OTR-T细胞目前还有许多未知，临床知识也是有限的，但是从研究中我们可以初步得出OTR-T细胞有潜力和优势成为免疫细胞疗法的新策略。

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结语
以高度精确的方式将转基因定位在任何所需要的基因座中的能力，开辟了许多可能性。新颖的基因组工程工具（例如CRISPR / Cas9）使研究人员能够以有针对性和精确的方式设计T细胞。
而细胞治疗策略的每一次进步都是为实现患者能够获得临床受益的可能，聚焦肿瘤免疫、新型抗体、干细胞再生医学、基因治疗等四个热门生物医药领域， 2020 BPIT 生物药创新技术大会将在中国南京国际青年文化中心拉开帷幕，相约2020年7月19-21日！
责任编辑：钟梦月