技术解读｜RRBS测序中因酶切人为引入碱基问题单酶切RRBS双酶切RRBS( 二 ) ：技术解读

同样，人工加入的序列有：
read1的：3'TWG
read2的：5'CWA和3'CWA
但是由于read2的3'CWA是原始非人工序列互补而来的，所以它不影响原始W和C链5'CWG中C碱基甲基化水平的计算。
所以需要去除的序列是：
read1的：3'TWG
read2的：5'CWA
第三种的变化为：
补平：
5'-CWGC=========CCG-3'（W链）3'-GWCG=========GGC-5'（C链）
BS转化：
5'-TWGT=========TTG-3'（BSW链）3'-GWTG=========GGT-5'（BSC链）
PCR:
5'-TWGT=========TTG-3'（BSW链）---read13'-AWCA=========AAC-5'（BSWR链）---read2
+
5'-CWAC=========CCA-3'（BSCR链）---read23'-GWTG=========GGT-5'（BSC链)---read1
同样，人工加入的序列有：
read1的：3'TG和3'TWG
【技术解读｜RRBS测序中因酶切人为引入碱基问题单酶切RRBS双酶切RRBS】read2的：5'CWA和CA ， 3'CWA和CA
但是由于read2的3'CWA和3'CA不影响原始W链5'CWG和C链5'CG中C碱基甲基化水平的计算。
所以需要去除的序列是：
read1的：3'TG和3'TWG
read2的：5'CWA和5'CA
第四种PCR后得到的序列为：
5'-TGG=========GTWG-3'（BSW链）---read13'-ACC=========CAWC-5'（BSWR链）---read2
+
5'-CAA=========ACWA-3'（BSCR链）---read23'-GTT=========TGWT-5'（BSC链）---read1
同样，人工加入的序列有：
read1的：3'TG和3'TWG
read2的：5'CWA和CA ， 3'CWA和CA
但是由于read2的3'CWA和3'CA不影响原始W链5'CWG和C链5'CG中C碱基甲基化水平的计算。
所以需要去除的序列是：
read1的：3'TG和3'TWG
read2的：5'CWA和5'CA
总结以上分析结果，得出结论：
双酶切RRBS需要去除的序列是：
read1的：3'TG和3'TWG
read2的：5'CWA和5'CA
cutadapt实现：
cutadapt
-aAGATCGGAAGAGC-AAGATCGGAAGAGC
-aTG$-aTAG$-aTTG$
-G^CA-G^CAA-G^CTA
-n2
-otrimmed.1.fastq.gz-ptrimmed.2.fastq.gz
reads.1.fastq.gzreads.2.fastq.gz
说明：
小写-a和-g表示切read1接头，大写-A和-G表示切read2接头
-a表示切3'接头， -g表示切5'端接头
-n表示对read最多需要剪切2次
前两个接是illumina通用接头的共同前缀部分，红色字体的A正是表示切补平后末端加的A
后面一个是上文说的双酶切RRBS需要切掉的碱基，每一行所列要切的序列之间是“或”的关系，故最多切2次， n设置为2 。
双酶切RRBS技术论文：Wangetal.BMCGenomics2013,14:11http://www.biomedcentral.com/1471-2164/14/11