1、常州市武进区环境监测站作业指导书 文件编号：WJES/QZ-0030-2003名称：水质 总大肠菌群测定作业指导书 第7页 共 7页 水质 总大肠菌群测定作业指导书1 含义及执行标准1.1 含义总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的 ， 在37生长时能使乳糖发酵 ， 在24小时内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌 。
1.2 方法原理多管发酵技术是以最可能数（most probable number ， 简称MPN）来表示试验结果的 。
它是根据统计学理论 ， 通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法 ， 具体是通过查MPN表获得结果的 。
1.3 水环境质量标准表1-1 总大肠菌群地下水质量分类 。

【总大肠菌群测定作业指导书|水质 总大肠菌群测定作业指导书】2、指标 （GB/T 14848-93）类 别类类类类类标准值（个/L）3.03.03.0100100表1-2 总大肠菌群生活饮用水卫生标准 （GB 5749-2006）类 别饮用水（MPN/100mL或CFU/100mL）标准值（个/L）不得检出表1-3 总大肠菌群渔业水质标准 （GB 11607-89）类 别贝类养殖一般渔业用水标准值（个/L）50050001.4 水污染物排放标准表1-4 总大肠菌群船舶污染物排放标准 （GB 3552-83）类 别内河沿海（距最近陆地4海里以内）沿海（距最近陆地412海里）标准值（个/L）2500250010000表1-5 总大肠菌群肉类加工工业水污染物排放 。

3、标准 （GB 13457-92）类 别禽类屠宰加工、畜类屠宰加工、肉制品加工一级二级三级标准值（个/L）25002500100002 分析方法2.1 方法名称、方法来源及适用范围方法名称：多管发酵法方法来源：水和废水监测分析方法(第四版)国家环保总局 2002年 第五篇 第二章 五(一)方法适用范围：此法适用于各种水样（包括底泥）的总大肠菌群测定 。
2.2 仪器高压蒸汽灭菌器电热干燥箱恒温培养箱显微镜冰箱采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干 。
2.3 标准菌株制备将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对 。

4、照控制 。
必须包括大肠埃希氏菌和山夫登堡沙门氏菌两种对照 。
接种完后需记录：母种的来源 ， 母种和工作种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件 ， 确认试验（存活度、纯度、关键诊断指标等） ， 母种到工作种的传代代数 。
2.4 培养基2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基 ， 按铭牌配制 ， 用定量加液器分装每个试管10ml ， 加塞 ， 在115灭菌20min ， 贮存于暗处备用 。
2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基 ， 按铭牌比例 ， 三倍配制（蒸馏水除外） ， 用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL ， 加塞 ， 在115灭菌20min ， 贮存于暗处备用 。
2.4.3 品红亚硫酸钠培养 。

5、基：市售品红亚硫酸钠培养基 ， 按铭牌配制 ， 分装于三角烧杯内 ， 加塞 ， 在115灭菌20min ， 贮存于冷暗处备用 。
2.4.4 伊红美蓝培养基：市售伊红美蓝培养基 ， 按铭牌配制 ， 分装于三角烧杯内 ， 加塞 ， 在115灭菌20min ， 贮存于冷暗处备用 。
2.3.5培养基存放于带紫外灯的灭菌物品专用贮藏柜中 ， 当培养基颜色变化 ， 或体积明显变化时废弃不用 。
2.5 分析步骤2.5.1 生活饮用水初发酵实验：在二个装有已灭菌的50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的大试管中（内有倒管） ， 以无菌操作各加入已充分混匀的水样100ml；在10支装有已灭菌的5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管） ， 以无菌操作加入充分混匀的水样1 。

6、0ml ， 混匀后置于37恒温箱培养24h 。
平板分离：经初发酵试验培养24h后 ， 发酵试管颜色变黄为产酸 ， 小玻璃倒管内有气泡为产气 。
将产酸产气及只产酸发酵管 ， 分别用接种环划线接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上 ， 置37恒温箱内培养1824h ， 挑选符合下列特征的菌落 ， 取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检 。
品红亚硫酸钠培养基上的菌落：紫红色 ， 具有金属光泽的菌落；深红色 ， 不带或略带金属光泽的菌落；淡红色 ， 中心色较深的菌落；伊红美蓝培养基上的菌落：深紫黑色 ， 具有金属光泽的菌落；紫黑色 ， 不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色 ， 中心色较深的菌落 。
复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌 ，。

7、则挑选该菌落的另一部分接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养基中（内有倒管） ， 每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落13个 ， 然后置于37恒温箱内培养24h ， 有产酸产气者 ， 即证实有大肠菌群菌存在 。

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