免疫共沉淀原理及步骤 _免疫共沉淀

科学研究蛋白中间相互作用不可或缺的实验是免疫共沉淀(CoIP)，常被用以评定特殊蛋白一氧化氮合酶的中不明蛋白成分，因其具备真实度高的优势，在如今临床医学科学研究中广泛运用，文中将为您详细说明CoIP的实验基本原理和操作流程，实验刚新手入门的同学们必读哦。
一、实验目地
1)检验二种总体目标蛋白是不是在身体相互作用;

文章插图
2)寻找与总体目标蛋白在身体存有相互作用的新蛋白。
应用此项技术性，或许你能有新的发觉哦!
二、实验基本原理
CoIP是运用抗原体蛋白和抗体的非特异融合、及其“Protein?A/G"非特异地融合抗体(免疫系统球蛋白)FC段的状况开发设计出去的方式。
现阶段要用Protein?A/G事先融合在Argarose?Beads上，使之与带有抗原体蛋白的水溶液(如细胞裂解液)及抗体(诱饵蛋白X抗体)反映后，Beads上的Prorein?A/G就能根据抗体吸咐诱饵蛋白X，诱饵蛋白X根据与靶蛋白Y相互作用将其从细胞裂解液中提取，进而做到免疫共沉淀的目地。
假如还是不懂，看图片就知道啦!
三、实验原材料
体细胞、RIPA缓冲溶液(RIPA buffer)、偶联反应有Protein A/G的免疫系统磁珠(Protein A/G
Beads)、诱饵蛋白X与靶蛋白Y的抗体、IgG对比抗体、移液枪、4度电冰箱及其超低温离心脱水机等。
四、实验流程(不一样实验室略微差别)
1) 制取细胞裂解液：搜集4x107体细胞，用PBS清洗后，添加1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂)，充足搅拌，冰面裂化30
min;4℃，12000 rpm抽滤10 min，搜集上清液。
2) 免疫共沉淀：在细胞裂解液中添加50 μl 50% Protein A/G Beads，4℃旋转混和孵育1 h开展预消除，抽滤后取0.5
ml上清液，添加3 μg诱饵蛋白X抗体，另取0.5 ml上清液添加相等同宗的IgG抗体做为对比，4℃晃动融合留宿;第二天每管添加50 μl 50%
ProteinA/G Beads，4℃晃动融合3 h;用RIPA Buffer清洗5次，每一次5 min 。
3) Western Blot剖析或MS质谱分析：沉定中添加25 μl 2×SDS loading Buffer，烧开10
min后抽滤取上清，用靶蛋白Y的抗体开展Western
Blot剖析，以检验总体目标蛋白是不是存有相互作用;或开展MS质谱分析，以寻找大量与诱饵蛋白X在身体存有相互作用的蛋白。
五、实验体会心得
你很有可能干了许多Co-IP实验，常常碰到的难题是检验不上与诱饵蛋白X相互作用的靶蛋白Y，或是检验获得的数据信号较弱。你是不是也遇到过呢?别着急，我暖心小结来啦!
出現之上难题的缘故很有可能有：
1)裂化液中的除垢剂过度强烈;
2)蛋白与蛋白中间的相互作用较弱或是不稳定。
一般的解决方案以下：
【免疫共沉淀原理及步骤】1)减少除垢剂浓度值或是拆换除垢剂类型(SDS>Trition>NP40>Digitonin>CHAPS);
2)挑选感染力高的抗体以捕捉大量的诱饵蛋白X进而捕捉大量的相互作用蛋白;
3)根据细胞转染过表达的方法提升诱饵蛋白X的成分;
4)添加有机化学偶联剂，提高诱饵蛋白X与相互作用蛋白的融合;
5)挑选诱饵蛋白X或是相互作用蛋白成分高的试品开展免疫共沉淀实验。
如何，你学好了没有?实际上要搞好免疫共沉淀实验想要你很多的工作经验累积，可是，假如你没空做实验，而且还急着发论文应该怎么办?
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