一文详述：CAR-T生产全流程解决方案梳理( 二 )

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▲ Gibco? CTS? Rotea?逆流离心系统Gibco? CTS? Dynabeads? CD3/CD28 磁珠, 提供可靠的技术平台用于免疫治疗中的分离，活化，和扩增T细胞。
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▲ Gibco? CTS? Dynabeads? CD3/CD28 磁珠 1.2 细胞激活 T细胞的激活通过T细胞受体（Signal 1）和CD28、4-1BB或OX40等共刺激信号（Signal 2），产生主要的特异性信号来实现。自体抗原呈递细胞，例如树突状细胞（DC），是T细胞反应的内源性激活剂。然而， DC的效力因患者而异，很难作为T细胞激活的可靠来源。激活会触发细胞分裂，从而促进基因转导，故细胞的激活方式与之后的基因转导效率息息相关。 CD3/CD28抗体偶联的超顺磁微珠，例如Dynabeads ，是目前用于T细胞活化最广泛使用的平台之一。
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▲ 图片来源：赛默飞世尔科技 CD3/CD28抗体磁珠Gibco? Dynabeads ，是可用于离体分离、活化和/或扩增T细胞的可靠技术。无论是对于多克隆T细胞、抗原特异性T细胞、基因修饰T细胞，调节性T细胞还是其他T细胞亚型， Gibco? Dynabeads都能使T细胞恢复到具有与体内活化T细胞相当的特性，并确保T细胞保持活力，以用于下游免疫肿瘤学分析。使用Gibco? Dynabeads磁珠刺激CD3/TCR和CD28信号转导途径，其活化和扩增高度一致，无需自体抗原呈递细胞 (APC)、有丝分裂原、抗原或饲养层细胞，并能够保留细胞因子谱和完整TCR ，人和小鼠T细胞均可适用。
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▲ Gibco? Dynabeads磁珠 02
细胞改造
实现CAR在T细胞上的表达，是CAR-T生产的核心技术，这一步需要利用到载体将CAR基因导入T细胞。理想的载体应该具有较高的基因转染效率、稳定性好，不引起机体免疫反应等特点。目前有多种方法用于T细胞修饰，包括病毒载体转导（如γ-逆转录病毒、慢病毒载体等）及非病毒载体转染（转座子转染、电穿孔等技术等）。已上市的5款CAR-T产品以病毒载体转导的方式为主，吉利德旗下Kite的Yescarta和Tecartus采用了γ-逆转录病毒载体，其它3款基于慢病毒载体开发，分别是诺华的Kymriah、Juno的Breyanzi ，以及百时美施贵宝/bluebird bio的Abecma 。2.1慢病毒慢病毒（LV）载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而实现目的序列的持久性表达。相比于其它病毒载体，使用LV载体的优势包括其可携带相对较大的负载，且遗传元件仅在整合后才有活性；因此，可相对简单地达到所需的滴度以及获得单个整合元件。用于将CAR转导进T细胞的LV载体，是CAR-T细胞生产过程中的关键原材料。 LV规模化生产的产能、成本、质量等各方面都将直接影响着CAR-T产品最终的治疗应用。最终的CAR-T细胞产品需“个体化”来自于每个患者，但编码CAR的病毒载体可以大量地生产，并在-80℃长时间储存。 LV载体多采用三质粒或四质粒瞬时转染包装细胞（如293 T/17或293 T细胞）的方法进行制备，制备周期一般为2周。