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文献精读

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懒癌患者福利——太长不看版

免疫检查点阻断疗法对抑制肿瘤效果显著，但是近来的研究报道了一些严重不良反应的病例，因此，寻找一种副作用更少的疗法势在必行。

2017年11月7日发表于Science子刊转化医学的一篇研究称，他们通过将热门的anti-PD-L1和anti-CTLA4抗体与一种细胞外基质超亲和多肽结合，通过瘤周注射，成功提高了治疗癌症的效果，并显著降低了副作用。这种简单可行的方法可以推广用于免疫检查点的阻断疗法。

正式读文献前，你需要了解这些

1、

免疫检查点是免疫系统用来保护宿主免受损害的一种抑制途径。最近，发现这些机制与癌症中避免免疫介导的排斥反应在功能上是相关的。 在此基础上，

免疫检查点阻断已经被证明是癌症治疗中很有前景的一种方法

。

2、

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4, CTLA4）是一种能够在调节性T细胞（T

regs

）上表达并且激活CD4

+

和CD8

+

T细胞的一种跨膜蛋白。它通过与抗原提呈细胞上的CD80或者CD86结合起到免疫抑制信号诱导剂的作用。CTLA4 阻断抗体 （aCTLA4）可以增强效应T细胞的活化。此外，

抗小鼠CTLA4克隆抗体9H10，通过抗体（Ab）依赖性细胞介导的细胞毒性耗尽调节性T细胞，进一步增强其抗肿瘤作用

。在临床上，aCTLA4（ipilimumab）的治疗使黑色素瘤患者的存活得到改善。

3、

有一些肿瘤细胞能够表达细胞程序性死亡配体（programmed death ligand 1，PD-L1）（CD274和B7-H1），它可以结合被激活的T细胞上的程序性细胞死亡蛋白（programmed cell death-1, PD-1）从而逃避免疫应答。PD-L1 / PD-1相互作用导致细胞因子的产生减少，抑制增殖作用，以及T细胞凋亡。

Anti-PD-1（aPD-1; pidilizumab，pembrolizumab和nivolumab）和anti-PD-L1（aPD-L1; atezolizumab和avelumab）的抗体在小鼠模型和临床中抑制肿瘤生长

。

                                        

4、

由于CTLA4和PD-1 / PD-L1的抑制途径是不重复的，aPD-L1和aCTLA4的结合使用具有协同抗肿瘤的作用

。nivolumab和ipilimumab的临床试验显示患者的存活延长，并且这些药物已经被FDA批准用于黑素瘤的治疗。但68.7％的患者表现出3或4级副作用。尤其是，由于治疗相关的副作用，36.4％的患者不能继续治疗。

5、

几个生长因子（growth factor, GF）中的肝素结合域（Heparin-binding domains , HBDs）可以与来源于细胞外基质（extracellular matrix, ECM）蛋白中的肝素结合域相结合。通过筛选GF与各种ECM蛋白的结合，我们发现胎盘生长因子-2（placenta growth factor–2, PlGF-2

123-144

）的HBD对多种ECM蛋白具有特别高的亲和力。之前的研究表明，

PlGF-2

123-144

结构域与GFs的融合增强了它们在小鼠皮肤和骨再生模型中的组织保留和治疗功效

。

研究结果

Figure 1. PlGF-2

123-144

多肽结合的IgG（PlGF-2

123-144

-IgG）以高亲和力与ECM蛋白结合并被纤溶酶释放。

1）

 PlGF-2

123–144

结合到免疫球蛋白G（lgG）抗体上的示意图（Fig. 1 A）。

2）

 SDA-PAGE得到的结果显示免疫球蛋白G的重链和轻链的质量都升高了（Fig. 1 B）。

通过ELISA实验检测到PlGF-2

123–144

–aCTLA4和PlGF

-2

123

–

144

–aPD-L1分别与8个不同的ECM蛋白（fibronectin纤连蛋白，fibrinogen纤维蛋白原，vitronectin玻连蛋白，osteopontin骨桥蛋白，type I, II, III, and IV collagens：I II，III和IV型胶原蛋白）结合，而未经修饰的aCTLA4和未经修饰的aPD-L1都未与所测试的ECM蛋白结合（Fig. 1, C和 D）

3）

 通过ELISA实验，可以观察到PIGF-2

123-144

-aCTLA4（9H10和4F10）和PlGF-2

123-144

-aPD-L1对皮肤ECM主要成分的纤连蛋白和I型胶原蛋白具有很强的结合亲和力（

K

d

值）。另外，PlGF-2

123-144

-aCTLA4和PlGF-2

123-144

-aPD-L1也识别其具有与未修饰的抗体相似的Kd值的目标抗原（Fig. 1 E）

4）

 以上数据都表明PlGF-2

123-144

-Abs可以结合ECM蛋白而不损害其抗原识别能力。

5）

 通过ELISA进行检测发现，在经过血纤维蛋白溶酶 (0.1 U/ml) 处理以后，PlGF-2

123–144

–rat IgG2a失去了与纤连蛋白和I型胶原蛋白的结合能力（Fig. 1 F）。这些结果表明，可以通过肝素或纤溶酶介导的在PlGF-2

123-144

肽内位点的酶切从ECM蛋白中释放PlGF-2

123-144

-Abs。

Figure 2. PlGF-2

123-144

结合降低了对检查点阻断抗体的系统暴露和潜在的治疗相关毒性

1）

 因为PlGF-2

123-144

-Abs在注射部位附近显示出长时间的滞留，所以我们假设血浆中抗体的浓度比未修饰的抗体浓度更低。为了检验这个假设，作者测量了血浆中随着时间推移的血浆中的抗体浓度。第0天在小鼠上接种B16F10细胞，在第4天给予小鼠单次给药aCTLA4，aPD-L1，PlGF-2

123

–

144

–aCTLA4, PlGF-2

123

–

144

–aPD-L1，和PBS（对照）。结果发现，注射后第一天所有组的浓度都是最高。此外，通过瘤周和腹膜内给未修饰的抗体（aCTLA4，aPD-L1）显示出相似的血浆浓度变化趋势。血浆中PlGF-2

123-144

-Abs的浓度与其未修饰形式的浓度相比较低。并且在注射后3天几乎检测不到，表明PlGF-2

123-144

结合可能降低aCTLA4 / aPD-L1的系统毒性（Fig. 2, A和B）

2） 

检测副作用。在肿瘤接种后第4天和第7天给药，然后检查血清细胞因子浓度和肝损伤标记丙氨酸转氨酶（ALT）。未修饰的抗体的施用增加了血清中的肿瘤坏死因子-α（TNFα）和干扰素-g（IFN-γ）浓度，而PlGF-2

123-144

-Abs则没有（Fig. 2，C和D）。另外，未修饰的抗体（但不是PlGF-2

123-144

-Ab处理）提高了血清中的ALT活性（Fig. 2E）。组织学分析显示未修饰的抗体引起肝脏显著的形态学改变和淋巴细胞的浸润（Fig. 2F），而PlGF-2

123-144

-Ab处理后组织结构相对保持。为了进一步评价通过PlGF-2123-144结合实现的降低的系统性毒性，我们使用非肥胖糖尿病（NOD）雄性小鼠，它低频率出现自发性糖尿病，但是在aPDL施用后通过PD-L1与胰岛细胞结合发生自身免疫性糖尿病。在第6天，未修饰的aPD-L1诱导了8只16周龄NOD雄性小鼠患上糖尿病，而在25天时，PlGF-2

123-144

-aPD-L1的糖尿病发病率为0％（Fig. 2G）。总之，这些结果表明PlGF-2

123-144

结合减少了检查点阻断抗体的系统毒性。

Figure 3. PlGF-2

123

–

144

–aCTLA4+PlGF-2

123

–

144

–aPD-L1的处理减少了 B16F10 黑素瘤的生长速率

1）

在表达卵白蛋白（OVA）的B16F10细胞接种后4天，每3天给予aCTLA4 + aPD-L1（每次注射25mg）三次。在这个剂量和治疗方案中腹膜内或瘤周注射未修饰的Ab都不表现出抗肿瘤作用。与此相反，PlGF-2

123–144

–aCTLA4 +

PlGF-2

123–144

–aPD-L1的瘤周给药显示了治疗效果，减缓肿瘤的生长和延长存活期（Fig. 3A）。

2）

aCTLA4 + aPD-L1 + PlGF-2

123–144

 多肽的给药（不结合）并没有产生抗肿瘤效果，这表明PLGF-2123-144的结合到抗体上是必不可少的。作者在接种了缺少OVA转基因的B16F10野生型细胞的小鼠上重复施用两种抗体。PlGF-2

123–144

–结合抗体延缓了肿瘤进展和延长了存活，而未修饰的Abs则没有（Fig. 3B）

3）

高剂量的PlGF-2

123–144

–Abs进一步抑制肿瘤生长和延长存活（Fig. 3C）

4）

在接种第七天注射PlGF-2123–144–combination Abs，也会让肿瘤的体积更小

5）

进一步增加剂量（每次300mg，两次，然后每次100mg，两次）再次减慢了PlGF-2

123-144

-Ab处理组中的肿瘤生长（Fig. 3E）

总之，这些数据表明，与未修饰的形式相比，用PlGF-2

123-144

-aCTLA4 + PlGF-2123-144-aPD-L1进行的局部治疗介导了稳定的抗肿瘤作用。

Figure 4. PlGF-2

123

–

144

–aCTLA4 + PlGF-2

123

–

144

–aPD-L1 的处理促进了T细胞的活力并且提高了B16F10 黑素瘤浸润CD8+T细胞的能力.

1）

在第0天，小鼠接种B16F10细胞，在第四天和第七天注射PlGF-2

123

–

144

–aCTLA4 + PlGF-2

123

–

144

–aPD-L1 (PlGF-2

123

–

144

–Abs), aCTLA4 + aPD-L1 (Abs), 或者 PBS。在第八天，肿瘤引流淋巴结(tdLN)中提取白细胞球。与Abs和PBS对照相比，PlGF-2

123

–

144

提高了CD8

+

和CD3

+

T细胞的数量和频率(Fig. 4, A 和 B).

2）

CD8+的效应子种群（定义为CD62L

?

CD44

+

）以及CD8

+

的PD-1

+

细胞数量增加了，表明了CD8

+

T细胞的激活(Fig. 4, C和D)

3）

肿瘤中的CD4

+

T细胞也增加了(Fig. 4, E和F), CD25

+

Foxp3

+

 Tregs在C4

+

T细胞中的百分率是没有显著性变化的。(Fig. 4H).

4）

为了检测肿瘤浸润的CD8

+

T细胞是否产生了更多的效应细胞因子和更高水平的细胞毒性，提取CD8 

+

 T细胞并使用aCD3和aCD28进行离体刺激。与对照相比，PlGF-2

123-144

-combination Abs增加了CD8 

+

肿瘤浸润T细胞中粒酶B 

+

（Gzmb 

+

），白细胞介素-2 

+

（IL-2

+

），TNFα

+

和IFN

-

的百分比（Fig. 4 I至L）。PlGF-2

123–144

–combination Abs不影响脾脏和肿瘤引流淋巴结肿的百分比，但中央记忆型细胞的PD-1

+

CD8

+

 T细胞提高了。这个结果表明这些PlGF-2

123-144

-Ab系统地增加了肿瘤抗原刺激过的T细胞。总的来说，PlGF-2

123–144

–aCTLA4 + PlGF-2

123–144

–aPD-L1的治疗措施有效地激活肿瘤浸润的T细胞，从而导致在图3中观察到的治疗效果。

Fig. 5. PlGF-2

123

–

144

–aCTLA4 + PlGF-2

123

–

144

–aPD-L1 处理减少系统抗肿瘤免疫

1）

 第0天在小鼠的左后方，第2天在小鼠的右后方分别接种B16F10细胞。随后，在第4天，第7天和第10天，在腹部瘤旁或左侧肿瘤腹膜内注射抗体（Fig. 5 A）。

2）

 PlGF-2

123-144

-combination Abs的瘤周注射减慢了左侧（同侧）和右侧（对侧）肿瘤的生长（Fig. 5 B和C）. 这些数据表明在一个肿瘤附近的PlGF-2

123-144

-aCTLA4 + PlGF-2

123-144

-aPD-L1治疗增强了系统性抗肿瘤免疫学活性。

Figure 6. PlGF-2

123-144

-aCTLA4 + PlGF-2

123-144

-aPD-L1处理在临床相关癌症模型中显示出抗肿瘤活性

1）

 为了将我们的结果扩展到可移植的肿瘤模型之外，我们使用Tyr：Cre-ER + / LSL-BrafV600E / Ptenf1 / fl小鼠，它可以通过Cre诱导活性Braf的表达以及Pten的等位缺失，通常可以改变人体黑色素瘤的分子途径。通过局部施用4-OH-tamoxifen诱导肿瘤后，在瘤周注射PlGF-2

123-144

-aCTLA4 + PlGF-2

123-144

-aPD-L1，与PBS处理或未修饰的抗体（ABs）处理组相比，基质结合Abs（PlGF-2

123-144

-ABs）显着减少肿瘤生长(Fig. 6A)。

2） 

作者同样地研究了乳腺癌的MMTV-PyMT（mouse mammary tumor virus–polyomavirus middle T antigen）模型，他们发现PlGF-2

123-144

- Abs的瘤周给药也抑制了这些小鼠中的肿瘤生长并且延长了存活(Fig. 6 B和C）。PlGF-2

123-144

-combination Ab施用在16只小鼠中的11只诱导根除肿瘤，而未修饰抗体的组合治疗在15只小鼠中的5只根除肿瘤。

3）

 为了评估长期抗癌免疫保护作用，将用PlGF-2

123-144

-combination Ab治疗消除肿瘤的小鼠用MMTV-PyMT细胞重新接种。这9个小鼠中只有1个发现了明显的肿瘤，但是所有幼虫都生长出可检测的肿瘤，表明PlGF- 2

123-144

-combination Abs诱导免疫记忆（Fig. 6 D）。

以上的数据表明PlGF-2

123-144

-aCTLA4 + PlGF-2

123-144

-aPD-L1治疗效果适用于多种癌症类型。

研究总结

1）

 研究人员将检查点阻断抗体与来自胎盘生长因子-2（PlGF-2

123–144

）的ECM的超亲和肽相结合，结果显示这个增强了组织保留并且降低了血浆中的抗体浓度，降低了系统性副作用，例如自动免疫糖尿病的风险。

2）

 在黑色素瘤和乳腺癌的鼠肿瘤模型中，与未修饰的抗体相比，瘤周给药PlGF-2

123–144

–anti-CTLA4和PlGF-2

123–144

–anti–PD-L1延迟了肿瘤的生长，延长了存活。

3）

 The PlGF-2

123–144

–Abs增加了肿瘤浸润活化的CD8

 +

和CD4 

+

 T细胞，导致远距离肿瘤生长的延迟。

4）

 这种ECM结合抗体的方法在检查点阻断疗法中可能是一种比较可行和安全的方法。

Reference：

Ishihara J, Fukunaga K, Ishihara A, et al. Matrix-binding checkpoint immunotherapies enhance antitumor efficacy and reduce adverse events. Science translational medicine, 2017, 9(415): eaan0401.

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