生物极客大讲堂 | 教你如何设计gRNA "

责编丨小程

本期要用到的工具：

Benchling

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第一步确定您想要定位的基因组区域

您需要首先找到哪些外显子存在于您的靶基因的所有转录物中。要在Benchling中获取此信息，请点击右上角的“create”，然后点击“create CRISPR”。在下一个对话框中，您可以搜索您感兴趣的基因。以下是在人类基因组（hg38）中搜索Ano6的示意图。

在Advanced Settings中，您可以选择所有转录物以在基因组上应用注释。

然后您可以查看您感兴趣的基因的所有转录物变体的外显子

为了使用CRISPR制作Ano6敲除细胞，您可以设计gRNA以定位红色矩形中的外显子，因为它包含在所有Ano6亚型中并接近5"末端。

小贴士：

确保目标位点上游没有关键的功能域，因为截断的蛋白质可能仍然有一些活性。您可以在

InterPro

或

MOTIF

中分析蛋白质功能域。

第二步找到你想要的靶点周围的所有可能的protospacer序列

同样以Benchling为例

在序列图上单击您想要定位的外显子以选择它，然后将其作为目标区域添加到Design CRISPR选项卡中

小贴士：

具有17或18个核苷酸的截短的gRNA可以减少脱靶效应而不损害切割效率。可尝试使用截断的protospacer来增加实验的特异性。你也可以通过使用成对的Cas9切口酶引入

插入缺失

来减少脱靶效应。

第三步选择至少两个可使脱靶效应最小化的protospacer序列

有时，一个gRNA比另一个更好

（尽管我们仍然不完全明白为什么）

。鉴于此，我们建议您设计和测试两个以上的protospacer序列，以增加创建基因敲除的成功率。

Benchling为每个protospacer序列计算中靶和脱靶分数。分数是根据Doench等人和Hsu等人开发的算法计算的。两个分数都在0到100之间，分数越高越好。这两个分数可以指导您选择好的protospacer序列。

脱靶评分告诉你Cas9脱靶的相反概率。分数越高意味着该序列与其他基因组中的序列结合的机会越小。

中靶分数表示Cas9的切割效率。您可以将得分看作给定gRNA在切割活性前20％以内的概率。请注意，评分系统不是线性的，只有5％的gRNA得到60分或更高的分数。最近，Doench等人改进了预测中靶和脱靶活动的算法。Benchling将修改评分算法以保持最新状态。

小贴士：

由于Cas9会在与靶序列结合后切割两条DNA链，因此您的原型空间序列可位于正负链上。您可能需要检查潜在的脱靶序列，以确定这些序列是否是您研究中相关基因的一部分。在测试中，您可以单击脱靶评分来查看这些序列（错配用红色表示）

参考文献：

Fu, Yanfang et al. “Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.” Nature biotechnology 32.3 (2014): 279-284.^

Ran, F Ann et al. “Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.” Cell 154.6 (2013): 1380-1389.^

Ran, F Ann et al. “Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.” Nature protocols8.11 (2013): 2281-2308.^

Doench, John G et al. “Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.” Nature biotechnology (2014).^

Hsu, Patrick D et al. “DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.” Nature biotechnology 31.9 (2013): 827-832.^

Shalem, Ophir et al. “Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.” Science 343.6166 (2014): 84-87.^

Doench, John G et al. “Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9.” Nature Biotechnology (2016).^

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