10x Genomics助力攻克登革热病毒：10xGenomics助力攻克登革

原标题：10xGenomics助力攻克登革热病毒
最近美国沃尔特·里德陆军研究所AdamT.Waickman等人通过10xGenomic平台在单细胞水平对登革热疫苗诱导的免疫细胞的异质性进行了研究。从单细胞层面全面阐述了细胞的作用机理，未来再有疫苗加持，登革热被攻克只是时间问题。接下来，小编将为大家呈上文献的精细解读！
文章题目：DissectingtheheterogeneityofDENVvaccine-elicitedcellularimmunityusingsingle-cellRNAsequencingandmetabolicprofiling
期刊：NatureCommunications
影响因子：12.19
发表时间：2019年8月
——摘要——作者主要通过10xGenomics公司的5’转录组方案在单细胞层面上对Tack-003疫苗注射后诱导的T细胞的免疫的分子机制进行了深入研究。通过缜密的逻辑，步步深入，最后得到一系列结论：
1.Tack-003疫苗可以对人体产生强大而持久的免疫效果；
2.Tack-003疫苗诱导的T细胞中存在一个细胞亚群，这个细胞亚群可以对登革热病毒产生持久的免疫效果；
3.找到并验证了TfR1可以作为一个可靠的maker来确定具有疫苗特异性反应T细胞的效应/记忆潜能。
——研究背景——全球每年有2.8~5亿人感染登革热。虽然大多数感染登革热病毒的人恢复得很快，但每年有将近50万人患严重的登革热，死亡率为2.5% 。早期使用系统生物学方法的研究集中在先天免疫特征上，这些特征与接种疫苗后的适应性CD8+T细胞反应相关。虽然这些研究揭示了与长期T细胞反应存在相关的不同的早期转录特征，但每一项研究都依赖于在群体水平上研究分类T细胞。 tako-003是一种重组的四价DENV疫苗平台，来自PDK-53DENV-2病毒株。该四价制剂也被证明在小动物和非人类灵长类动物模型中具有安全的免疫原性，并能够提供保护免疫，以对抗DENV的挑战。这篇文章就是旨在单细胞水平上对tack-003接种后体内免疫细胞的免疫反应进行研究。
1-样本处理样本类型：PBMC细胞，关于PBMC单细胞悬液的处理可以参照10x官网
2-数据分析5’转录组数据和T细胞的V(D)J区的组装都是通过10x官方软件CellRanger完成；细胞分选通过流式完成。
3-研究结论第一步，研究Tack-003疫苗产生免疫效果的持久性
结论：Tack-003疫苗可以在人体内产生强大而持久的细胞免疫反应，至少可以持续120天。
研究方法：对接种Tack-003疫苗的55个体的CD8+T细胞通过流式细胞仪进行研究。通过对CD38/HLA-DR的检测来判断CD8+T细胞的活化程度。为了验证疫苗是否有持久的免疫效果，作者在第0天和第120天分别用DENV-1到-4对应的NS1、NS3、NS5和CprM/E蛋白的肽池刺激，并用ELASPOT的方法对免疫效果进行定量，发现注射Tack-003疫苗后其免疫效果可以至少持续120天。

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图1
第二步，用10x单细胞技术找到具有抗原特异性的CD8+记忆T细胞并对其特点进行研究
1）鉴定具有抗原特异性的CD8+记忆T细胞的类型
对T细胞激发期（14天）的CD38+HLA-DR+和CD38–HLA-DR–的T细胞以及记忆期（120天）的具有NS1和NS3特异性的T细胞分别进行流式CD25/CD69分选。将分选到的细胞分别用10x5’免疫组库产品进行单细胞的V（D）J的全长测序，根据互补决定区3（CDR3）区序列的差异将这些细胞分类到不同的克隆型（Clonetype）。然后将120天中具有NS1和NS3抗原特异性的T细胞中排列前十的Clonetype与14天的CD38+HLA-DR+T细胞的Clonetype进行比对，发现在120天中排列前十的T细胞类型无论是NS1还是NS3特异性的T细胞在14天中CD38+HLA-DR+T细胞中都是可以找到，只是所占比例有所不同。说明CD8+T细胞在活化前期已经出现了具有NS1和NS3特异性的T细胞类型。
【10x Genomics助力攻克登革热病毒】

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图2
2）结合单细胞5’转录组数据对14天中具有NS-1和NS-3特异性的T细胞类群进行分析验证
对T细胞激发期（14天）流式分选得到的CD38+HLA-DR+T细胞进行10x5‘转录组以及V（D）J区的全长测序，最终捕获到1019个单细胞，其中有1003个细胞得到了V（D）J区的全长序列，效率达到了惊人的1003/1019% 。这些细胞根据其基因表达的差异可以分为四个细胞亚群图（a）。将这些细胞和注射疫苗后120天后的NS1和NS3特异性的T细胞的TCR的序列进行比对，得到有143个细胞的TCR序列能够重合如图（d），有意思的是发现这143个细胞基本上都来自cluster1 ，这就预示着在tack-003疫苗刺激后14天后有一个独特的CD38+HLA-DR+T细胞亚群可以发育成长为持久的记忆细胞。