恒光讲堂｜肾排泄型荧光多肽探针用于红外二区活体肿瘤成像：恒光讲堂

原标题：恒光讲堂｜肾排泄型荧光多肽探针用于红外二区活体肿瘤成像
本文要点：作者开发了一款新型多肽CP ，可靶向肿瘤干细胞标志物CD133 ，将其与近红外荧光探针偶联后（CP-IRT），该探针在小鼠体内实现了有效地肿瘤靶向，其肿瘤与正常组织的信噪比大于8 ，此外，得益于多肽的修饰，该探针可以在6小时内被肾脏代谢87% 。

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基于配体-受体介导的分子识别肿瘤生物标志物靶向探针在体内成像、癌症早期诊断和靶向治疗方面越来越受到人们的关注，作为小分子界面配体，多肽具有细胞穿透性，低免疫原性，高生物相容性和易于合成的特点。如今，可以生产具有特定结合特性的肽，使其具有与多种靶标（包括癌症生物标志物蛋白）的结合特性。与抗体相比，多肽可以提供相似的高亲和力和选择性，而无需复杂的结构，并且在较小的尺寸和更快地从体内清除方面具有优势，多肽也可用于与抗体不兼容的有机溶剂中的化学反应。研究表明，在NIR-II窗口（1000-1700nm）中发射更长波长的荧光探针可以从减少的光散射中受益，从而可以使生物组织的成像深度更深。 NIR-II荧光成像还受益于组织自发荧光的减少，在亚厘米成像深度具有高信噪比的情况下还可以提高空间分辨率。到目前为止， NIR-II荧光团已包括无机纳米材料（碳纳米管，量子点和稀土纳米颗粒）以及聚合物或脂质体包裹的疏水有机染料，这些纳米探针缺乏快速排泄的能力。基于纳米粒子的NIR-II显像剂大部分保留在肝脏和脾脏中，并通过粪便途径缓慢排出，较长的保留时间导致了长期的安全隐患。基于以上，作者开发了一款新型肽CP(图1a)用于靶向肿瘤标志物CD133受体，与D-A-D型染料通过点击化学偶联后，可以快速通过肾脏排泄。

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图1：a）CP的化学结构：b）对CD133进行CP的SPRi检测；c）CP配体和CD133受体的分子对接模拟示意图；d）FITC标记的CP（绿色通道）和PE标记的CD133抗体（红色通道）与HT-29细胞核指示剂Hoechst33342（蓝色通道）共定位。
作者首先研究了探针的细胞成像性能。利用等离子体金芯片，作者验证CP-IRT探针的CD133的靶向性，如图2a所示， CD133阳性细胞系HT-29和U87MG细胞荧光均强于CD133阴性细胞系HEK293T ，这表明CP-IRT探针对CD133的亲和力较高，体外细胞成像进一步证实了这个结论（如图2b所示）。

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图2：a）等离子体金芯片法用于检测CP-IRT的靶向性能；b）CP-IRT对CD133阳性细胞系HT-29和U87MG以及CD133阴性细胞系HEK293T细胞成像实验。
作者随后进行了动物体内成像实验。利用HT-29移植瘤小鼠模型，尾静脉注射探针后，在初始阶段便可以观察到小鼠的血管（图3a），在两小时后，肿瘤/正常组织信噪比达到最大（T/NT≈8.3），而不修饰靶向肽的Free-IRT探针则不能有效富集于肿瘤组织（图3d），预先注射阻断剂量的CP肽使得CD1333受体被饱和，随后注射探针，同样在两小时成像时发现肿瘤的荧光信号降低，这说明CD133受体被饱和。

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图3：a）静脉注射CP-IRT并在808nm激光激发下，利用1200nm长通滤光片对CD133+肿瘤小鼠在不同时间点进行成像；b）荷瘤的C57BL/6小鼠的光学数码照片，蓝色边框是NIRⅡ成像视图；c）注射CP-IRT后2h整个小鼠体内的荧光强度分布图，包括肝脏和肿瘤；d）CP-IRT与FreeIRT的T/NT信噪比随时间变化的曲线；e）仅由CP肽阻断后，对CP-IRT注射后第2h进行NIR-II成像。
最后，作者对探针的排泄行为进行研究。在注射探针后， NIRⅡ成像显示大多数探针由膀胱排泄，如图4a所示，在第370s时膀胱显示出荧光信号，在150s时可以观察到小鼠两个尿道的荧光信号（图4b），从而实现了尿道无创成像，为未来研究动物尿道疾病提供了工具。最后，作者对比了多肽偶联探针与抗体偶联探针的肾脏排泄性能。作者将CP-IRT的排泄行为与蛋白质和抗体偶联的IRT的排泄行为进行了比较，相对于分子量约100kDa的肽，抗体是大型的功能蛋白。作者发现IRT染料与抗体和较小的蛋白质（如牛血清白蛋白（BSA））结合可导致肝脏高摄取而无肾脏排泄（图4c）。动态光散射测量（图4d）显示CP-IRT尺寸约为5nm（在肾脏排泄范围内），而BSA-IRT尺寸约为25nm ，远高于肾脏滤过界限。因此，具有小的有机NIR-II染料的多肽偶联探针显示出从主要器官中快速清除的优势，而没有在RES系统中长期保留的问题，而这通常是用抗体染料探针或基于纳米颗粒的荧光团所常见的。