8、应多于4个 。
引物与非特异性扩增区无同源性 。
引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应 ， 即错配 。
长度：1530个核苷酸 。
常用18-27bp 。
引物需要足够长 ， 保证序列独特性 ， 并降低序列存在于非目的序列位点的可能性 。
但是长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性 。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交 ， 降低了特异性 ， 而且会导致其延伸温度大于74 ， 不适于Taq DNA 聚合酶进行反应 。
引物序列在模板内应当没有相似性较高 ， 尤其是3端相似性较高的序列 ， 否则容易导致错配 。
引物3端出现3 个以上的连续碱基 ， 如GGG 或CCC ， 也会使错误引发机率增加,引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较 。

9、大的影响 。
末位碱基为A 的错配率明显高于其他3 个碱基 ， 因此应当避免在引物的3端使用碱基A 。
5端序列对PCR 影响不太大 ， 因此常用来引进修饰位点或标记物 。
选择 GC 含量为40到60或GC 含量与模板GC 含量接近的引物 。
引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, ) 。
设计 5端和中间区为G 或C 的引物 ， 这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性 。
过高或过低都不利于引发反应 。
两引物的Tm 值相差不应大于5。
DNA熔解温度 ， 指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度 。
不同序列的DNA ， Tm值不同 。
DNA中GC含量越高 ， Tm值越高 ， 成正比关系 。
复性温度=Tm 。

10、值-(510)在Tm值允许范围内 ，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合 ，提高PCR反应的特异性 。
复性时间一般为3060sec ， 足以使引物与模板之间完全结合 。
对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点 ， 应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定,5. Premier 5.0 使用,Premier”的主要功能分四大块 ， 其中有三种功能比较常用 ， 即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif)查找 。
“Premier”还具有同源性分析功能 ， 但并非其特长 。
此外 ， 该软件还有设计简并引物、DNA与蛋白质序列的互换等功能 。
简并引物：有时候 ， 对于引物设计仅了解有限 。

【PCR|PCR引物设计】11、的序列信息 。
比如 ， 如果仅知道氨基酸序列 ， 可以设计简并引物 。
简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物 。
为了增加特异性 ， 可以参考密码子使用表 ， 根据不同生物的碱基使用偏好 ， 减少简并性,猪的UCP3基因（脂调节基因）的第五外显子（exon）序列 1.输入目的基因序列 2.选中primer图标 ， 点S图标 。
开始设计正义链 。
3. edit primer,在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基TTA， 完成后点analyze ， 认为可以后点OK 。
4.设计反义链引物 。
5.显示满足设计参数的候选结果 。
6.Rating表示引物评分 ， 优选评分高的,无连续 U串,G/C含量较少 。

来源：(未知)

【学习资料】网址：/a/2021/0323/0021755570.html

标题：PCR|PCR引物设计( 二 )