1、PCR 引物设计,PCR primer express,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)体外核酸扩增技术,能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断 。
PCR使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的DNA片段扩增数百万倍 。
该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系 ， 其建立极大地推动了生命科学的研究进展 。
在DNA重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值,PCR技术的创建,Kary B. Mullis（穆利斯（美,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交 。

2、,再用DNA聚合酶延伸,扩增DNA的设想 。
1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现 。
1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 。
1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖,1. PCR的基本原理,PCR的原理是根据待测DNA片段两端的核苷酸序列 ， 设计并人工合成两个分别与DNA片段两端互补的寡聚核苷酸引物 ， 在有过量的引物、过量的底物（4种dNTP）、DNA聚合酶以及模板的反应体系中 ， 经过高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段的循环周期 ， 对DN 。

3、A分子进行扩增 。
由于新合成的DNA双链能够作为下一循环的模板 ， 所以模板DNA以几何级扩增 。
一般经过30-35次扩增循环 ， 可使目的基因DNA片段放大数百万倍,2. PCR体系的主要成分,模板DNA（靶基因） 特异引物 底物dNTP 耐热性DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶） Mg2+缓冲液 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶 。
此酶具有以下特点：耐高温 ， 在70下反应2h后其残留活性大于原来的90% ， 在93下反应2h后其残留活性是原来的60% ， 在95下反应2h后其残留活性是原来的40% 。
在热变性时不会被钝化 ， 不 。

4、必在每次扩增反应后再加新酶 。
大大提高了扩增片段特异性和扩增效率 ， 增加了扩增长度(2.0Kb) 。
由于提高了扩增的特异性和效率 ， 因而其灵敏性也大大提高,1）模板 单、双链DNA均可 。
不能混有蛋白酶 ， 特别是染色体中的组蛋白、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类 。
一般100ng DNA模板/100L 。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 。
（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应非特异性扩增 ， 且可增加引物之间形成二聚体的机会 。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量过高可引起反应非特异性扩 。

5、增;
酶量过少则合成产物量减少,4）dNTP浓度 取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 ， 如果有一种浓度不同于其他几种 ， 就会引起错配 。
浓度过高易产生错误碱基的掺入 ， 浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合 ， 使游离的Mg2+浓度下降 ， 影响DNA聚合酶的活性 。
（5） Mg2+浓度 Mg2+是DNA聚合酶的激活剂 。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系 。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高反应特异性降低 ， 出现非特异扩增 。
Mg2+可与负离子结合 ， 所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度,three steps: D 。

6、enaturation (变性): 将反应体系加热至90-97 ， 使模板DNA完全变性成为单链 ， 同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除 。
Annealing (退火): 当温度突然降低至45-65,引物与其互补的单链DNA模板在局部形成杂交链 。
Extension (延伸): 将温度升高至70-74下 ， 在Taq DNA 聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下引物沿着模板DNA延伸 。
利用PCR仪来控制温度,3. How PCR works,聚合酶链式反应,1. Denaturation,2. Annealing,3. Extension,以上三个步骤构成一个循环 ， 新合 。

7、成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板 ， 经多次循环（2530）次即可达到扩增DNA片段的目的,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,5 Essential Components of PCR Reaction,PCR动画,4. 引物设计原则,引物设计是PCR技术中至关重要的一环 ， 其优劣直接关系到PCR的特异性和实验能否成功 。
引物要与模板链的序列紧密互补 。
合成的一对引物分别与待测DNA的5端和3端互补 。
引物内和引物之间不能形成稳定的二聚体或发夹结构 。
这会破坏引物退火稳定性 。
引物内部和引物之间不应有互补序列 ， 一般来说 ， 引物内部以及引物之间连续互补的碱基不 。

来源：(未知)

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标题：PCR|PCR引物设计