5.8 适用于PC或应的Taq DNA聚合酶(5 U/科L)及其反应缓冲液 。
5.9 引物和探针：序列信息应按附录A执行 。
用TE缓冲?夜(5.6)或重蒸储水将上述引物和探针稀释到10d mol/L储存备用 。
注：探针应避光保存 。
5.10 植物DNA取试剂盒 。
5.11 定量PC取应试剂盒 。
6仪器6.1。

9、分析天平：感量0.1 g 和0.1 mg 。
6.2 普通 PCRa和 Real-time PCR 仪 。
6.3 重蒸水发生器或超纯水仪 。
6.4 核酸定量仪 。
6.5 其他相关仪器设备7操作步骤7.1 抽样和制样按NY/T 672和NY/T 673规定的执行 。
7.2 试样预处理按NY/T 674规定的执行 。
7.3 DNA莫板制备按NY/T 674规定的执行 ， 或使用经验证适用于玉米 DNA提取和纯化的植物DNA试剂盒 。
7.4 DN砥取质量测定紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是 2闻/mL50闵/mL 。
当提取的DNA溶液O D 260nm/OD280nm的比值在1.72.0时 ， 满足PCR检测要求 。
7. 。

10、5 对照设置在PCR反应的同时 ， 应设置阴性对照和空白对照 。
以非转基因玉米DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板； 以转基因玉米Bt11 DNA作为阳性对照的模板； 以重蒸水作为空白对照PCR反应体系的模板 。
7.6 PCRt性检测按农业部869号公告-3-2007规定的执行 。
zSSIIb ,说明试样提取的DNA满足PCR当pcr反应体系正常工作时 ， 试样中扩增出内标准基因 nZ检测要求 。
同时 ， 对试样进行转化体Bt11的检测 ， 若出现扩增条带 ， 且扩增大小与预期片段大小一致 ， 则初步判断样品中含有转化体Bt11 ,应通过实时荧光弓PCR进一步确认；若无扩增条带 ， 则判定试样中不含有转化体Bt11 。
7.7。

11、实时荧光PCR测7.7.1 实时荧光PCR体系及反应条件 。
实时荧光PCR体系反应体系和反应条件参照附录 B和附录C执行 。
反应体系和反应条件应根据 试剂要求进行适当调整 。
每个反应体系设置3个平行 。
7.7.2 质控标准在扩增内标准基因zSSIIb时 ， 空白对照荧光曲线平直 ， 阴性对照和阳性对照出现典型的扩增曲线 ， 或空白对照荧光值低于阴性对照和阳性对照荧光值的15%,表明反应体系正常工作；在扩增检测转化体Bt11时 ， 空白对照和阴性对照的荧光曲线平直 ， 阳性对照出现典型的扩增曲线 ， 且检测Ct值36或空白对照和阴性对照的荧光值低于阳性对照荧光值的15%,表明反应体系正常工作 。
否则 ， 表明PCR反应体系不正常 ，。

12、需要查找原因重新检测 。
8结果分析与表述a) 试样中内标准基因检测 Ct值36,转化体Bt11检测Ct值40,则表明该试样中不含转基因 成分Bt11 。
表述为 样品中未检测出抗虫和耐除草剂玉米Bt11,检测结果为阴性b) 试样中内标准基因检测 Ct值36,转化体Bt11检测Ct值36,则表明该试样中含有转基因 成分Bt11 。
表述为 样品中检测出抗虫和耐除草剂玉米Bt11,检测结果为阳性c) 试样中车t化体 Bt11检测Ct值在3640,则需调整模板浓度 ， 重新检测 。
经重复检测后 ， 当 检测体系正常时 ， 转化体 Bt11 检测Ct值40,则表明该试样中含有转基因成分Bt11,表述为 样品中检测出抗虫和耐除 。

13、草剂玉米Bt11,检测结果为阳性”；否则 ， 表明该试样中不含转基因成分Bt11 ,表述为 样品中未检测出抗虫和耐除草剂玉米 Bt11 ,检测结果为阴性9防污染措施转基因抗虫和耐除草剂玉米 Bt11的实时荧光PC检测过程的防污染措施应符合 NY/T 672的规http: /bzxx 仅供学习交流使用 ， 请勿传播或其他用途AA附录 A（规范性附录）实时荧光PCR佥测引物和探针序列信息表A.1被检测基因引物或探针序列扩增长度/bpzSSIIb-F： 5 -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG -3zSSIIbzSSIIb-R： 5 -AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-388bpzSS 。

14、IIb-P：5 -fam-taaggagcactcgccgccgcatctg-Tamra-3Bt11-F: 5 -GTGTGGAATTGTGAGCGGATAAC -3Bt11Bt11-R: 5 -CCGAGGAGGIIICCCGATATTAC -393bpBt11-P:5 -FAM-AAAGTCTCAATAGCCCTCTGGTCTTCTGACGAG-BHQ1-3http: /bzxx 仅供学习交流使用 ， 请勿传播或其他用途BB附录 B（规范性附录）实时荧光PCR佥测反应体系表B.1试剂终浓度体积水8 gL2X TaqMan Mix1X12.5 gL10 ii mol/L上游引物0.4 g mol 。

【DB34T1433|DB34T1433-抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种实时荧光PCR检测方法】15、/L1 gL10 1 mol/L下游引物0.4 g mol/L1 gL10 g mol/L 探针0.2 g mol/L0.5 gL25 mg/L DNA 模板2 mg/L2.0 gL总体积25.0 gL注1：如果PCRg冲液中含有氯化镁 ， 则不加氯化镁溶液 ， 加等体积无菌水 。
注2:玉米内标准基因PCR测反应体系中 ， 上下游引物和探针分别为zSSIIb - F/R和zSSIIb - P;
转基因玉米Bt11转化体PCR测反应体系中 ， 上下游引物和探针分别为Bt11 F/R和Bt11-Pohttp: /bzxx 仅供学习交流使用 ， 请勿传播或其他用途CC附录 C（规范性附录）实时荧光PCR佥测反应条件表C.1被检测基因预变性扩增循环数zSSIIbBt1195 c ,10 min95C ,15 s ;

稿源：(未知)

【傻大方】网址：/a/2021/0905/0024106876.html

标题：DB34T1433|DB34T1433-抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种实时荧光PCR检测方法( 二 )