细胞免疫抑制=对感染的易感性大大增加
公猪精子质量降低=受精率下降=繁殖性能降低
仔猪出现水肿=弓背僵直,步调失调
胃溃疡 1主题内容与适用范围
本标准规定了谷物和大豆中赭曲霉毒素A的薄层色谱测定方法 。
本标准适用于小麦、玉米和大豆中赭曲霉毒素A的测定 。
在薄层板上赭曲霉毒素A的最低检出量为4ng 。该方法的最低检测量为10μg/kg 。
2原理
用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取样品中的赭曲霉毒素A,样品提取液经液-液分配后,根据其在365nm紫外光灯下产生黄绿色荧光,在薄层色谱板上与标准比较测定含量 。
3试剂
以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂,水为蒸馏水或同等纯度的水 。
⒊1石油醚(60~90℃或30~60℃) 。
⒊2甲醇 。
⒊3三氯甲烷 。
⒊4甲苯 。
⒊5乙酸乙酯 。
⒊6甲酸 。
⒊7冰乙酸 。
⒊8乙醚 。
⒊9苯-乙腈(98:2) 。
⒊100.1mol/L磷酸[c(H3PO4)=0.1mol/L]:称取11.5g磷酸(85%)加水稀释至1000mL 。
⒊112mol/L盐酸溶液[c(HCL)=2mol/L]:量取20mL盐酸,加水稀释至120mL 。
⒊124%氯化钠溶液 。
⒊130.1mol/L碳酸氢钠溶液[c(NaHCO3)=0.1mol/L]:称取8.4g碳酸氢钠,加适量水溶解,并用水稀释至1000mL 。
⒊14硅胶G:薄层层析用 。
⒊15赭曲霉毒素A(以下简称OA)标准溶液:用苯-冰乙酸(99:1)配成40μg/mL赭曲霉毒素A贮备液,并用紫外分光光度计测定其浓度 。浓度的测定参照GB5009.22《食品中黄曲霉毒素B1的测定方法》中2.14条(赭曲霉毒素A的最大吸收峰波长333nm,分子量403,克分子消光系数值为5550) 。精密吸取贮备液,用苯稀释成每毫升含赭曲霉毒素A0.5μg,赭曲霉毒素A标准液应置冰箱中避光保存 。
4仪器
所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡,用自来水,蒸馏水冲洗 。
⒋1小型粉碎机 。
⒋2电动振荡器 。
⒋3玻璃板:5cm×20cm 。
⒋4薄层涂布器 。
⒋5展开槽:内长25cm、宽6cm、高4cm 。
⒋6紫外光灯:365nm 。
⒋7微量注射器:10μL、50μL 。
⒋8具0.2mL尾管的10mL,小浓缩瓶 。
5分析步骤
⒌1提取
⒌1.1甲法
称取20g粉碎并通过20目筛的样品,置于200mL具塞锥形瓶中,加入100mL三氯甲烷和10mL0.1mol/L磷酸,振荡30min后通过快速定性滤纸过滤;取20ml,滤液置于250mL分液漏斗中,加50mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液振摇2min,静置分层后,将三氯甲烷层放入另一个100mL分液漏斗中(少量乳化层,或即使三氯甲烷层全部乳化都可放入分液漏斗中),加入50mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液重复提取三氯甲烷层,静置分层后弃去三氯甲烷层(如三氯甲烷层仍乳化,弃去,不影响结果) 。碳酸氢钠水层并入第一个分液漏斗中,加约5.5mL2mol/L盐酸溶液调节pH2~3(用pH试纸测试),加入25mL三氯甲烷振摇2min,静置分层后,放三氯甲烷层于另一盛有100mL水的250mL分液漏斗中,酸水层再用10mL三氯甲烷振摇、提取、静置,将三氯甲烷层并入同一分液漏斗中 。振摇、静置分层,用脱脂棉擦干分液漏斗下端,放三氯甲烷层于一75ml蒸发皿中,将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干 。用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解,转入具尾管的10mL浓缩瓶中,置80℃水浴锅上用蒸汽加热吹氮气(N2),浓缩至干,加入0.2mL苯-乙腈(98:2)溶解残渣,摇匀,供薄层色谱点样用 。
⒌1.2乙法
称取20g粉碎并通过20目筛的样品加于200mL具塞锥形瓶中,加30mL石油醚和100mL甲醇-水(55:45),在瓶塞上抹上一层水盖严防漏 。振荡30min后,通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中,待下层甲醇水层分清后,取出20mL滤液置于100mL分液漏斗中,用pH试纸测试,一般为pH5~6 。加入25mL三氯甲烷振摇2min,静置分层后放出三氯甲烷层于另一分液漏斗中,再用10mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇-水层(在用三氯甲烷振摇提取时,如发生乳化现象,可滴加甲醇促使其分层),将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中,加入50~100mL4%氯化钠溶液(加入量视品种不同而异,大豆加100mL,小麦、玉米则加50mL左右),振摇放置(如为大豆样品提取液还须轻轻反复倒转分液漏斗,使乳化层逐渐上升 。如乳化严重可加入少许甲醇),待三氯甲烷层澄清后,用脱脂棉擦干分液漏斗下端,放三氯甲烷层于75mL蒸发皿中(如为大豆样品须再加入10mL三氯甲烷振摇,三氯甲烷层合并于同一蒸发皿中),将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干 。
以下操作自“用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解”起,按甲法操作 。
⒌2测定
⒌2.1薄层板的制备
称取4g硅胶G,加约10mL水于乳钵中研磨至糊状 。立即倒入涂布器内制成5cm×20cm,厚度0.3mm的薄层板三块,在空气中干燥后,在105~110℃活化1h,取出放干燥器中保存 。
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