基因编辑技术发展及其在家畜上的应用( 三 ) _小知识

随着第三代基因编辑技术 CRISPR/Cas 系统的横空出世，立刻成为了基因编辑历史上的又一重要的里程碑。该技术克服了传统的基因编辑技术的操作周期长、打靶效率低、应用范围窄的缺点。CRISPR/Cas 系统的不断研发和多元化发展拓展了该技术的应用领域，并且使该技术用起来更完美，更简单，效率更高，脱靶效应大大降低，安全性更好，成为目前基因编辑技术的主流方法和工具。
二、三种新型基因编辑技术的优劣
三种新型基因编辑技术(ZFN, TALEN 和 CRISPR/Cas)均能实现基因组的定点修饰和编辑，应用范围有很大程度的重合，但是这三种技术在使用方面有不同的技术特点和适用范围(表 1) 。ZFN技术最先发现，研究应用时间比较长，技术较为完善，但 ZFN的识别结构域中存在广泛的上下文依赖效应，在对 ZFN 的选择方面还有很大的难度，且成本较高，产生较强的细胞毒性，容易引起基因组中其他基因的突变以及染色体畸变(Pattanayak et al.,2011; Radecke et al., 2010) 。TALEN技术相比ZFN技术，其识别位点及选择范围变得较宽，而且成本大大降低，打靶效率显著提高和细胞毒性显著降低，但是其限制因素是在识别位点前的第一个碱基必须是胸腺嘧啶，且构建 TALEN 模块比较复杂，费时费力。最近几年兴起的 CRISPR/Cas 技术，其打靶效率和适用性要比 TALEN 和 ZFN 技术高很多，但是也不可避免的存在一些不足，目前主要存在的问题是PAM序列的依赖性与脱靶效应(Fu et al.,2013;Hsuetal.,2013) 。

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三、基因编辑技术在家畜上的应用
01
在家畜抗病育种中的应用
家畜疾病频发给养殖业带来了巨大的经济损失，是目前制约畜牧业发展的重要因素;人畜共患病的爆发同样威胁着人类的安全。此外，家畜疾病还带来了一系列诸如环保、抗生素残留以及食品安全等问题。人们逐渐意识到，单纯依靠防疫和药物治疗已无法彻底防控家畜疾病。近些年，科学工作者将新型基因编辑技术应用于家畜抗病育种中去，取得了很大的进展。
Richt 等(2007)运用传统的同源重组技术在牛体内敲除了朊蛋白基因(prionproteingene,PRNP)，使其脑部的PrPC蛋白表达显著下调，可以防止由朊蛋白造成的疯牛病(Mad cow disease)的发生。笔者所在实验室利用 ZFN 技术将外源的人溶菌酶基因和溶葡萄球菌素基因定点插入到牛酪蛋白位点 (CSN2)，通过克隆技术获得了对乳腺炎具有抗性的奶牛(Liuetal.,2013;Liuetal.,2014) 。同时，本实验室还利用TALEN和CRISPR/Cas9技术，将外源的 SP110 基因和 NRAMP1 基因定点插入到牛基因座内，生产出具有抗结核病功能的转基因牛，研究结果不仅对牛结核病的防御与控制有重大意义，同时为动物抗病育种提供新思路(Gao et al., 2017; Wu et al., 2015) 。有研究发现，猪 CD163 蛋白是猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)病毒感染猪肺泡巨噬细胞的主要受体(Calvert et al., 2007) 。美国密苏里大学 Whitworth、英国爱丁堡大学罗斯林研究所 Burkard 以及浙江大学王少华等分别利用 CRISPR/Cas9 技术成功获得了 CD163 基因敲除猪，对 PRRS 病毒具有显著抗性，猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)抗病猪的产生对于人类对抗对养猪业具有致命性打击的繁殖与呼吸综合征的发生具有重要意义(Burkard et al., 2017; Whitworth et al., 2015; 王少华等, 2018) 。
02
在家畜生产性状改良中的应用
肌肉生长抑制素基因(myostatin, MSTN)是肌肉生长的负调控因子，该基因的表达可抑制肌细胞的增殖与分化，对该基因进行突变有利于肌肉的生长发育，可以显著增加肌纤维的直径、提高肌纤维数量(Mcpherron, Lee, 1997) 。Luo等(2014)利用锌指核酸酶技术首次生产出 MSTN 基因敲除的牛，这些牛表现出显著的双肌表型，大大提高了肉牛的产肉量, 为高瘦肉率肉牛、肉羊等肉用家畜新品种培育奠定基础。Wang (2015)年报道应用CRISPR/Cas9 技术，将 sgRNA 和 Cas9RNA 共注射到绒山羊(Capra hircus)原核期胚胎，经胚胎移植生产出了同时敲除 FGF5 基因和 MSTN 基因的山羊，山羊被毛长度显著增加，且呈现双肌表型，实现了在山羊体内同时敲除多个基因，加快了优质绒山羊的培育。在 Yu 等(2016)利用 TALEN 技术结合体细胞核移植技术靶向敲除了山羊体内的 MSTN 基因，生产出了三只发育良好的敲除MSTN 基因的山羊，说明了TALEN技术同样可以对山羊的基因组进行定向编辑，为TALEN技术应用于山羊的育种提供了可能。Wang 等(2016)利用 CRISPR/Cas9 系统结合原核注射技术在绵羊(Ovis aries)体内同时实现了 MSTN、刺鼠信号蛋白基因(agouti signal protein, ASIP)和 β-胡萝卜素加氧酶2基因 (beta-carotene oxygenase 2, BCO2)三基因靶向敲除，且在潜在的脱靶位点未发现脱靶效应，表明CRISPR/Cas9技术可以同时针对多个基因进行可遗传修饰，且有较低的脱靶效应，达到有效改善家畜生产性能的目的。此外，还有多家单位利用 CRISPR/Cas9 系统获得了 MSTN 基因敲除的家畜动物(Guo et al., 2016; Wang et al., 2017)，并积极用于扩繁育种建群。