基因编辑技术发展及其在家畜上的应用 _小知识

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摘要
近年来出现的几种以人工核酸酶为代表的新型基因编辑技术，包括锌指蛋白核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)技术、转录激活因子样效应核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技术、成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins, CRISPR/Cas)系统，在科学研究以及家畜育种等方面已被广泛应用。这些基因编辑技术是通过特异性结构识别靶位点，核酸酶发挥切割作用，对靶位点进行定点编辑，具有高效准确、制作简单等特点。
基因编辑技术是指人为地对目的基因进行移除和定点插入的操作，从而实现特定基因的敲除和敲入等。基因编辑技术可以实现在细胞水平，器官水平，以及个体水平进行精确而有效的基因组编辑，从而被广泛应用于生物技术领域。
在过去的数十年中，一系列通过核酸内切酶介导的新型基因编辑技术被开发出来，主要包括锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)技术，转录激活因子样效应核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技术和成簇的规律间隔的短回文重复序列相关核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins, CRISPR/Cas)系统。这三种核酸酶基于由序列特异性的 DNA结合结构域与非特异性的 DNA切割结构域组成(Carroll, 2011; Urnov et al., 2010) 。他们通过特异性结合 DNA 序列，产生双链断裂(double-strand breaks, DSBs)，启动细胞自身 DNA 修复机制，以非同源末端连接 (non-homologous end joining, NHEJ)或者同源重组修复(homology directed repair, HDR)的方式进行基因高效精确编辑(Wyman, Kanaar, 2006) 。这三种新型基因编辑技术已经在细菌(Shipman et al., 2017)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Xie et al., 2018)、人类(Homo sapiens)细胞(Verma et al., 2017)、食蟹猴(Macaca fascicularis)(Yao et al., 2018)、果蝇(Drosophila melanogaster)(Denecke et al., 2017)、斑马鱼(Barchydanio rerio)(Zhang et al., 2017)、爪蟾(Xenopus laevis)(Delay et al., 2017)、小鼠(Mus musculus)(Nakasuji et al., 2017; Roper et al., 2018)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Ryder et al., 2017)、水稻(Oryza sativa)(Yin et al., 2017)、小麦(Triticum aestivum)(Shan et al., 2013) 等多种生物体中得到了广泛的研究和应用。在三种主要家畜动物猪(Zheng et al., 2017)、牛(Gao et al., 2017; Wu et al., 2015)、羊(葛恒涛, 2016; 朱红梅, 2016)上的应用，近些年也取得了很大的进展。
一、新型基因编辑技术介绍
01
ZFN 技术
ZFN又称锌指蛋白核酸酶(zincfinger protein nuclease, ZFPN)，是一种经过人工改造的核酸内切酶。科学工作者 1983 年首次在非洲爪蟾卵母细胞的转录因子IIIA 中发现了与 DNA 具有特异性结合亲和力的锌指蛋白(zinc finger protein, ZFP) (Mani et al., 2005) 。其在20世纪90年代末首次得到研究和应用(Bibikova et al., 2003)，从而实现了基因的高效定点编辑，开创了基因修饰的先河。
ZFN其结构主要由两部分组成，即ZFP构成的特异性 DNA 结合域(DNA-binding domain)和 DNA切割域(DNA cleavage domain) (Kim et al., 1996) 。DNA切割域由限制性内切酶FokI演变而来，DNA结合域用于识别特定的DNA序列，位于ZFN的 N 末端。含有大约 30 个氨基酸残基的锌指 (Zinc-finger, ZF)是构成 ZFP 结构域的 DNA 结合基序(DNA-binding motif) (Klug, 2010) 。可以将多个锌指结构组装到一起，用以识别更长的 DNA 序列。因此，通常将 3~6 个 Cys2His2 类型的锌指结构相结合，组装构成 ZFP 结构域，其在 DNA 链上沿着 3'到 5'的方向与靶序列相结合(Gaj et al., 2012) 。FokI 切割域位于 ZFN 的 C 末端，FokI核酸酶发现于海床黄杆菌(Flavobacterium okeanokoites)，其在细菌体内通过二聚化发挥核酸内切酶的活性，使目的基因位点产生双链断裂(Palpant, Dudzinski, 2013) 。一对 ZFN 的两个单体分别由其 3'到 5'以及 5'到 3'方向识别靶标 DNA 双链，两个FokI核酸酶切割域发挥切割作用，特异性的打靶目的基因(Hauschild-Quin- tern et al., 2013) 。锌指核酸酶使用的关键是构建识别不同碱基的 ZFP，通过优化氨基酸的组成来达到基因精确编辑的目的。
在基因编辑过程中，把锌指核酸酶的质粒载体导入细胞后，载体上的核定位信号将会引导锌指核酸酶进入细胞核，锌指 DNA 结合域将与目标序列发生特异性结合，FokI切割域于两个结合位点的间隔区切割产生DNA双链断裂(Carroll, 2011)，细胞可通过 HDR 或 NHEJ 方式产生基因敲除、点突变、基因敲入，从而实现基因的定向修饰操作(Kim, Kim, 2011) 。