引物探针问题怎样消除引物二聚体 _探针

实时定量PCR分析的部分实施需要优化，以确保所有响应参数设置准确，从而获得准确的结果。常见的荧光定量PCR包括引物、探针、反应抑制和软件分析等几个方面。今天姐分享一下她在引物和探针方面的经验。

实时定量PCR (qPCR)几乎是现代分子生物学中最重要和最广泛使用的核酸定量检测技术。一个成功的定量PCR检测离不开准确的检测设计和操作流程。

引物二聚体引物二聚体的形成是最常见的问题之一。当引物对之间的一些序列具有同源性时，可以形成引物二聚体。如果PCR反应过程中引物退火形成二聚体，Taq DNA聚合酶可以延长二聚体，形成一个好于原始引物的产物，在循环过程中更容易导致退火缺陷。

问:引物二聚化会带来什么问题？
引物二聚体对反应的影响在很大程度上取决于反应中使用的化学物质。基于荧光探针的反应受引物二聚体的影响不大，是引物二聚体区域探针退火断裂的现象。这时，引物的竞争是一个需要考虑的重要问题。基于双链DNA的染料组合的响应受引物二聚体的影响很大。因为染料结合是非特异性的，所以在响应过程中监测的荧光信号可以被加强。这会相应地改变Ct值，使结果出现偏差。
问:如何确定引物二聚体是否存在？
凝胶电泳是一种显示引物二聚体的极好。引物二聚体在凝胶底部形成扩散带，通常低于100 bp 。单独凝胶电泳分析的缺点是灵敏度只达到纳克级，不一定能得到结果。
解链曲线也是显示引物二聚体的一种。如果扩增具有优异的特异性，实时荧光定量PCR板上每个反应孔的解离曲线会出现一个窄的单峰。引物二聚体的荧光强度较低，显示出宽的“波形”，表明它在约70°C时熔化(见图1) 。

问:如何设计和优化实验以避免引物二聚体？
更好在引物设计阶段就采取简单的预防措施，从一开始就避免二聚体的形成。如果出现引物二聚体，有很多可以减少或消除。
1.首先，优化热循环条件，这对提高退火温度很重要。在大多数情况下，两步循环(从95℃变性步骤到60℃退火和延伸步骤)有利于强扩增，因此引物设计中设定的获胜退火温度为60℃ 。
2.可以降低引物的浓度，即使正向引物和反向引物的比例不同，也会有一定的支持。大多数情况下，每种引物的理想终浓度为200~600 nM，但必要时可降至60 nM 。
3.镁的更佳浓度一般为3 mM左右，高于此浓度，容易形成引物二聚体。
4.如果引物形成二聚体的偏差没有被评估，评估应该被补偿和重新设计(如果必要) 。一般来说，更好通过加热启动DNA聚合酶，在冰上反应。
【引物探针问题怎样消除引物二聚体】5.理论上，对于相同的目标，应该同时检测多个引物组。这实际上可以节省很多时间，因为如果这些引物中的一个可以立即工作，就可以减少优化过程中花费的时间。

以及引物和探针的储存。引物和探针储存不当会导致降解和特异性丧失，进而影响反应效果。影响引物和探针稳定性的重要因素有保存温度、保存时间、是否长时间暴露、保存的引物和探针的浓度、保存液的成分等。

问:如何长期保持引物和探针的稳定性？
引物和探针的稳定性有四个关键点。冻干引物在保存时间和温度方面具有更好的灵红豆博客活性。底火一旦复溶，应保存在-20°C，如果保存超过一年，应监测其药效是否下降。对于标记引物和探针，应采取措施避免暴露标记(例如，使用不透明管并将其保存在暗处)，以延长其应用寿命。
引物的浓度也会影响其稳定性。建议底漆储存浓度不低于10m；；其实大多数情况下，100 M的底漆浓度更简单。引物和探针也要分开保存，以减少冻融次数，尤其是标记的引物和探针。最后，TE缓冲液可以形成比水更稳定的环境。此外，含有0.1 mM EDTA的TE缓冲液(刻度TE含有1 mM EDTA)是一种假想的溶液，因为一些PCR反应可能对EDTA有一些残留的敏感性。

NTC放大当形成引物二聚体时，如果使用与DNA双链结合的染料，在NTC反应中也可以观察到荧光信号。还有一种情况。在污染物存在的情况下，无论是基于探针的反应还是双链DNA结合染料的反应，在NTC孔中也会观察到引物二聚体的扩增。这可能是一个随机事件，并不是所有的NTC都会被扩增，通常是由不寻常的样品添加问题引起的。如果在每次NTC反应中都出现扩增，则很可能有一两种试剂被污染。

问:如何防止或消除污染？

引物探针问题 怎样消除引物二聚体

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