实验时间 | 聚合酶链式反应（PCR）

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正文开始：

PCR 技术应用领域

1. 检验感染性疾病是否处于隐性或亚临床状态；

2. 有效检测癌基因的突变，准确检测癌基因的表达量；

3. 临床应用于检测地中海贫血的基因突变。

实验原理

PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR 由变性 -- 退火 -- 延伸三个基本反应步骤构成：

重复循环变性 -- 退火 -- 延伸三过程，就可获得更多的「半保留复制链

」

，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟， 2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

常见问题及对策

假阴性，不出现扩增条带

1. 模板原因

① 模板中含有杂蛋白质。

② 模板中含有 Taq 酶抑制剂。

③ 模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。

2. 酶失活

① 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

② 忘加 Taq 酶或溴乙锭。

3. 引物

① 引物质量。

② 引物的浓度。

③ 两条引物的浓度是否对称。

解决对策

① 选定一个好的引物合成单位。

② 引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③ 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

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