还在用试剂盒提取质粒的你，懂得它背后经历了什么吗？说起提取质粒

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正文开始：

说起提取质粒，想必是做分子生物学的搬砖工们每天的常规工作。随着各大公司开发出各种质粒提取 kit，为苦逼的生物狗带来了福音—试剂再也不用自己配了，提取步骤再也不用那么繁琐了。

但，你先别着急高兴，久而久之，很多刚进实验室的小白师弟师妹再也不懂得背后的原理：质粒提取出来掺杂有蛋白或者基因组 DNA 怎么办？待转染或酶切的质粒被有机溶剂污染了怎么办？且听我一一道来。

质粒是独立于基因组外的小型环状 DNA 分子，能够自我复制，在分子克隆中是最常用的外源基因载体。在自然状态下，质粒常存在于细菌中，携带对宿主在某些特殊情况下的抗性基因，例如抗生素抗性基因。

举个栗子，如图所示，这是质粒 pBR322 的示意图，第一个被广泛用作基因载体的质粒。不仅能够独立自主复制（ori），而且在多克隆位点（Multiple cloning sites）处可以插入想要表达的目的基因，将插入目的基因的质粒转化到细菌或真核细胞中，在合适的条件下目的基因便可得到表达。

为了方便验证转化是否成功，质粒上还带有筛选标记——抗性基因，在质粒 pBR322 中是 amp 和 tet 抗性。在转化后，向培养基中加入 amp 或 tet，能够生长的菌株就是成功转化的。

说了这么多，我们怎么得到这么好的质粒呢？下面我想大家介绍一种最经典，也是最灵活的质粒提取步骤和每个步骤的原理。

一一

细菌的培养

1. 从琼脂 LB 平板上挑取单菌落，接种到液体 LB 培养基中，过夜培养。

Tips：

菌体里的质粒一般含有抗生素抗性基因，在细菌培养过程中要向培养基中加入相对应的抗生素，以防质粒丢失。

二

细菌的收获，裂解

细菌的收获一般通过离心进行，而细菌的裂解有多种方式，包括离子型/非离子型去污剂，有机溶剂，或者碱裂解，加热等。选择哪一种方式主要看质粒的大小，大于 15kb 的大型质粒要注意采用温和的方法（溶菌酶法），剧烈的方法容易使它收到破坏。

而小于 15kb 小型质粒则可采取相对剧烈的方法（碱裂解法或煮沸法）。由于我们平时大多质粒都小于 15kb，所以今天主要讲最常用的碱裂解法小提质粒。

1. 将培养过夜的大肠杆菌培养液倒入 1.5 ml 小离心管中，在小离心机中 12 000 rpm，4 ℃ 离心 30 s。

2. 尽可能倒干培养液上清。

3. 将细菌沉淀，所得重悬于 100 μl 用冰预冷的溶液 I 中，剧烈振荡。

溶液 I

50 mmol/L 葡萄糖

25 mmol/L Tris HCl（pH8.0）

10 mmol/L EDTA（pH8.0）

Tips：

这一步主要作用是重悬菌体，EDTA 是金属螯合剂，主要作用是防止下一步的裂解过程中内切酶对质粒进行切割。

4. 加入 200ul 新配置的溶液 II，盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，切勿震荡，将离心管置于冰上。

溶液 Ⅱ

0.2 mol/L NaOH（临用前用 10 mol/L 贮存液现用现稀释）

1% SDS

Tips：

菌体在强碱性条件下裂解，释放出包括质粒在内的核酸，蛋白等物质。注意混匀要轻柔，否则基因组 DNA 裂解成小片段，有可能对质粒造成污染。SDS 作用是结合蛋白质，为下一步做准备。

5. 加 150μl 用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡 10 秒钟，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上 3-5 分钟。

溶液 Ⅲ

5 mol/L 乙酸钾 60 ml

冰乙酸 11.5 ml

水 28.5 ml

Tips：

这一步主要作用是中和，避免质粒长时间在碱性条件下造成损伤，此时质粒溶解在中和液上清中。SDS 的钾盐是不溶于水的，也直接导致与之结合的蛋白质沉淀，由于基因组 DNA 很大，而且与部分蛋白质结合，也造成了共沉淀。

6. 在小离心机中 12 000 rpm，4 ℃，离心 5 min，将上清转移到新离心管中。

Tips：

经过离心，不溶的大分子核酸，蛋白质等物质被沉淀下去，而可溶的质粒在上清中。

7. 加等体积得酚: 氯仿，振荡混匀，用微量离心机于 4 ℃ 以 12 000 g 离心，上清转移到另一离心管中。

Tips：

虽然经过沉淀可以去除大部分蛋白质，但还是有部分蛋白残留，所以利用蛋白质在酚中强烈变性，可以比较彻底的将蛋白质抽提掉。酚在水中微溶，所以加入氯仿，以便使酚溶解在有机相中。而且增加有机相的比重，离心后使水相和有机相更彻底的分开。吸取上清时，会看到明显的两相分界线，分界线上会看到薄薄的一层白色，这就是变性的蛋白质，注意不要吸到上清中。如果用的是酚的水溶液抽提，那么还要再加上一步氯仿抽提，以除去残留的酚，否则会致使酶切，PCR 等反应不能正常进行。

三

质粒的回收

1. 用 2 倍体积的无水乙醇于室温沉淀质粒。振荡混合，于室温放置 2 分钟。

Tips：

乙醇沉淀 DNA 的优点是，它可以与水任意比例混溶，而且不与质粒发生反应，顺便还可以溶解去除上一步的有机溶剂，在高浓度盐的溶液中，加入无水乙醇更容易让质粒沉淀。

2. 在小离心机中 12 000 rpm，4 ℃，离心 5 min，收集沉淀的质粒。

3. 小心倒去上清液，将离心管倒置在纸巾上，排干残留的无水乙醇。

4. 加入 1 ml 的 70% 乙醇水溶液，盖紧盖管，颠倒数次，在小离心机中 12 000 rpm，4 ℃，2 min，回收质粒。

Tips：

在质粒提取过程中，溶液 I，II，Ⅲ中的盐还残留在离心管中，这一步主要作用是溶解残留的盐，质粒沉淀在下面，达到提纯的效果。

5. 倒掉上清，倒置在纸巾上，在空气中将酒精溶液会发干净，直到试管中没有可见液体。

Tips：

注意一定要将酒精溶液挥发干净，否则同样影响进一步的酶切等反应。这里有个小技巧送给大家，小编平时如果急用的话，会把 EP 管放进超净台，打开通风，这样 15 min 左右就完全挥发干净啦。

6. 加入 50 ul 的去 RAN 酶和 DNA 酶的 TE 溶液震荡重新溶解质粒，储藏于 -20 ℃ 备用。

Tips：

如果有灭菌的蒸馏水也是可以的。

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