干货分享 | 让基因干扰易如反掌借助工具

RNA 干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象（图 1）。由于使用 RNAi 技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达（长度超过三十的 dsRNA 会引起干扰素毒性），所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。

图 1：RNA 干扰作用机制示意图。可以发现化学合成的 dsRNA 与内源性 miRNA 其实是殊途同归

如何干扰一个目的基因？

1. 对于常规的编码基因，转录出的 mRNA 基本都是定位在细胞质中。对于这种基因的干扰，可以化学合成 dsRNA。dsRNA 通常 21～25 bp，短小精悍，很容易被转染到目的细胞（系）中。

通常，为了避免脱靶效应，每个目的基因需要合成 3 条甚至更多，从而确保至少两条 dsRNA 效果一致；dsRNA 的缺点像优点一样明显：干扰效果不能稳定遗传下去。所以，与之对应的是利用慢（逆转录）病毒病毒载体介导 shRNA 从而形成稳转系，干扰效果可以持续。

同样地，主流做法是每个基因至少两条 shRNA 且效果一致。道理明白了，那怎么设计有效的 dsRNA 或者 shRNA 吧？请继续往下看：

「君子性非异也，善假于物也」。人之所以为人就是因为善于利用工具（吸血鬼貌似也会使用工具）。Thermo 旗下有个 BLOCK-iT? RNAi Designer 工具，注册进去界面如下：

图 2： BLOCK-iT? RNAi Designer 工具界面

我们可以选择 siRNA（dsRNA）（框 1）或者 shRNA（框 2），然后把你的 mRNA 号输进去（框 4）或者直接贴序列（框 5）。下面还有物种选择，然后设计即可。这个工具还有其他几个功能，自己探索，统统是傻瓜式操作。结果会被标识星星，5 星是最优的。

设计完后那问题又来了：设计的序列效果一定好么？实话是说，未必。

凡是能百分百保证的效率，不是耍流氓就是算命的。但如果是别人文章里发表过的序列呢？这个也需要辩证的参考，毕竟不是什么样的文献都靠谱。

除此之外，sigma 还有一个网站，上面会收录基于经典干扰载体 pLKO.1 的验证过的序列（图 3，图 4）。我的建议是这个序列可以优先参考。

还有一个事实：同一干扰序列在不同的细胞系里（同一物种）干扰效率也可以差别很多。结论很明显了，优先参考优质文献发表过和 sigma 网站 validation 的序列；次之可以用 BLOCK-iT? RNAi Designer 工具预测设计。

图 3：点击价格按钮会出现如图 4 的靶点序列信息

2. 大家需要注意的是，上述 RNA 干扰发生的场所-细胞质。换言之，只有定位细胞质的 RNA 才有可能被 RNAi 的方法干扰掉。

但事实是，很多 RNA，如 lncRNA、circRNA 等非编码 RNA 会定位于细胞核内，RNA 干扰相关复合体根本接触不到，更遑论干扰掉了。那这种就任由他们闹妖了么？当然不是，一种称为 ASO 的特殊修饰过的翻译核苷酸（phosphorothioate-modified antisense oligodeoxynucleotides）可以成功进入核内，达到敲低的目的。

图 4：靶点信息，其中带 Validation 标签的代表该序列被验证过

3. 以上两点掌握了基本可以闯荡江湖了，但肯定还没完。我们回到图 1，dsRNA 与内源性 miRNA 其实是殊途同归。这句话提示，RNA 干扰还可以通过 miRNA 的结构来构建并达到干扰的目的（基于 microRNA 的 shRNA）。

讲到这儿，我们需要科普点基础知识。众所周知（我假设大家知道），常规启动 shRNA 的启动子是 U6（也有用 H1 的）；而普通编码基因的表达都是由 CMV、SV40、EF1α 等启动子驱动。那二者的区别是什么呢？其实，CMV、SV40、EF1α 等属于聚合酶 II 型（polII）启动子，可以启动较大的基因转录，如编码蛋白的基因、miRNA、lncRNA 等，而且需要 polyA 等转录终止信号，而 U6 属于聚合酶 III 型（polIII）匹启动子，缺少组织特异性，主要用来启动比较短的 RNA，如 shRNA、CRISPR 系统的 gRNA 等 500nt 以下的小 RNA，而且末端需要 4～6 个连续的 T 来终止转录（一般用 6 个 T）。

目前组织特异性启动子，如肝脏组织特异的 TBG、心肌特异的 cTNT、肌肉特异的 MCK，以及神经元特异的 Syn 等，均属于 II 型启动子。综上，我们可以通过组织特异性启动子来驱动基于 miRNA 结构的 shRNA（microRNA-adapted shRNA）的组织特异性转录，从而实现特异性组织的基因干扰。典型的代表例子是 RNA 干扰领域大名鼎鼎的 Dharmacon 公司（现在属于 GE）家的产品（图 5，图 6）

图 5：基于 miRNA 结构的 shRNA 介导基因干扰示意图

图 6： MicroRNA-adapted shRNA 示意图

RNA 干扰，大体就这些事儿。看完以上攻略，快速开展干扰实验吧......

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文章来源：汉恒生物

图片来源：汉恒生物

题图来源：汉恒生物

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