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作者：子非鱼

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宝“剪”锋从磨砺出！CRISPR的问世确实带来了基因编辑的黄金时代，编辑人类胚胎、闯入临床研究、“霸屏”CNS，每一项都足以振奋人心。而2017年CRISPR似乎更具魔力，它以前所未有的精度，可对各种生物体的DNA做出微调。如今，年终盘点季，小编将带领大家一起回顾一下“魔剪”CRISPR技术在过去一年的“丰功伟绩”。

图片来源：Sketching-Science Twitter

CRISPR的新玩法——微调DNA

CRISPR虽然备受科研者青睐，但它对DNA突变区域“一刀切”的简单粗暴做法，却引来了不少微词。为了实现零副作用这个终极目标，研究者们给CRISPR增添了新技能——微调DNA。

1  不切DNA，照样也能治疾病

美国沙克生物研究所的研究者开发出一种新型CRISPR-Cas9系统，能在不切开DNA的前提下，对基因进行激活。他们将Cas9酶表达基因插入一个腺相关病毒（AAVs）的同时，利用另一个AAV引入短sgRNA和转录激活剂。sgRNA只有14或15个核苷酸，可阻止Cas9切割DNA，并促使其与转录激活剂协同作用。

值得一提的是，该系统在多种疾病小鼠模型中实现了“疾病逆转”，如急性肾脏疾病小鼠模型、1型糖尿病小鼠模型和肌肉萎缩症小鼠模型。这也证实了新CRISPR技术是安全的，不会产生不想要的基因突变。

参考文献：In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation (DOI:10.1016/j.cell.2017.10.025)

2  自由替换DNA碱基，精准打靶

2016年，哈佛研究者成功利用CRISPR技术将DNA的C转化为U，即实现了C?G碱基对向T?A碱基对的转换。而今年同一个研究团队再次开发出了“新碱基编辑器”ABE（Adenine Base Editor）实现了C?G向T?A的转换。

简单来说，就是一种改造后的TadA酶，将靶DNA链中的腺嘌呤（A）转换为肌苷（I，I可起到类似鸟嘌呤G的作用），然后“诱骗”细胞修复另一条DNA链以完成碱基对的转换。研究者利用该技术成功逆转了与遗传学血色病相关的G-to-A突变。

参考文献：Programmable base editing of A?T to G?C in genomic DNA without DNA cleavage (DOI: 10.1038/nature24644)

3设置“关闭开关”，更好驾驭CRISPR

为了避免CRISPR误伤友军，Doudna教授团队则通过两种anti-CRISPR蛋白（ACR）——AcrIIC1 和AcrIIC3，以不同的策略来抑制Cas9酶。前者可直接结合到Cas9酶保守的HNH催化域来阻止多种不同Cas9同源DNA切割；后者通过诱导了Cas9的二聚化来阻止Cas9绑定靶向DNA。

另外，他们还发现升级版Cas9蛋白（如eSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1）之所以能实现更精准的DNA切割，是因为其负责感知靶向结合准确性的REC3域发生了突变，使得它们结合非靶目标时，更不容易激活它的“剪刀作用”。

参考文献：A Broad-Spectrum Inhibitor of CRISPR-Cas9

(DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.07.037)

http://www.nature.com/articles/nature24268#affil-auth

挖掘新技能，CRISPR“瞄上了”RNA

既然CRISPR已将DNA纳入囊中，又怎会放过DNA的“近邻”RNA呢。近期，CRISPR家族就已经磨刀霍霍向RNA了。

1  抢RNAi饭碗，编辑RNA

张锋研究团队测试了来自15种不同微生物的Cas13a（C2c2酶），最终发现LwaCas13a可比以前的RNA敲低工具（RNAi）更强的特异性在靶RNA上切割特定位点，脱靶效应低。另外，他们还找到了Cas13的“死亡变体”，即能结合RNA，却不能进行切割作用。且该版本的Cas13可通过结合荧光标记来追踪RNA的轨迹。

参考文献：RNA targeting with CRISPR–Cas13 (DOI:10.1038/nature24049)

2  筛选lncRNA，CRISPR更方便

研究者研发一种基因组规模的CRISPR-Cas9激活筛选，能够靶向超过10000 lncRNA转录起始点，以识别影响表型的非编码位点。结果发现有11个lncRNA位点，通过招募激活剂在人类黑色刘细胞中调节对BRAF抑制剂的耐药性；且大多数候选位点均可调节附近的基因。

因而研究可以通过这一筛选工具，系统性的发现非编码吗位点的功能，并阐明它们在基因调控和细胞功能中的多种作用。

参考文献：Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood (DOI:10.1038/nature24009)

3  首次证实circRNA与大脑息息相关

Cdr1as是哺乳动物大脑中高表达的一种环状RNA，因其从DNA反义链转录而来，没有良好表达的线性等价物，导致其相关功能的分析缺失。

研究者在发现Cdr1as可以和miR-7、miR-671均结合后，则利用CRISPR-Cas9选择性删除了小鼠中的Cdr1as基因，结果发现miR-7的水平下调了，miR-671的水平上调了。而且Cdr1as敲除小鼠中与大脑活性相关的“即刻早期基因”（如Fos，且很多为miR-7靶标）的表达发生了变化，而小鼠也表现除了异常的神经元活动。

参考文献：Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function (DOI:10.1126/science.aam8526) 

攻克疾病，CRISPR大有可为

老实说，无论CRISPR靶向是DNA，还是RNA，其最终目的都是为了攻克疾病，将其从人体上彻底驱除出境，还给人们一个健康的机体。

1  挖掘AML白血病新药靶标

AML作为一种侵袭性血癌，患者的存活率极低。研究者先构建了携带人AML细胞可能存在突变的靶基因的小鼠后，利用CRISPR系统性测试每个基因，并发现46个潜在的候选基因（产生修饰RNA的蛋白）是AML细胞存活所必需的。

其中METTL3是具有最强影响的基因之一，且它虽是AML细胞存活所必需的，但却不是健康血细胞所必需的，因而也就成为了不错的潜在药物靶标。

参考文献：Promoter-bound METTL3 maintains myeloid leukaemia by m6A-dependent translation control (DOI:10.1038/nature24678

2  牵手CRISPR，打造CAR-T2.0时代

英国的研究者利用CRISPR技术，对杀伤性T细胞进行基因改造，移除它们的非癌症特异性受体，并将这些受体替换为能识别和摧毁特定癌细胞的受体，从而为抵抗一系列癌症提供新的希望。

参考文献：CRISPR-mediated TCR replacement generates superior anticancer transgenic T-cells (DOI：10.1182/blood-2017-05-787598)

3  变“钝”的“剪刀”带来新启示

众所周知，离基因编码区相隔几万个碱基对的增强子是通过严格的时空特性对基因进行精确调控，否则基因表达就会发生紊乱。研究者利用CRISPR activation（CRISPRa，可靶向激活DNA序列，而非切割）确定了IL-2RA基因的增强子区域，并发现如果该区域出现故障，则细胞难以起到抑制炎症反应的能力，从而导致自身免疫病的发生。

参考文献：Discovery of stimulation-responsive immune enhancers with CRISPR activation (DOI: 10.1038/nature23875)

4  抑制血管生成，不遗余力治疗眼疾

血管生成可导致视力丧失和失明，是多种退行性眼部疾病的一种特征。而研究者利用腺相关病毒（AAV）运送靶向VEGFR2的CRISPR系统，可成功阻止视网膜中的血管生成，为以病理性眼球内血管生成为特征的眼部疾病新疗法提供了依据。

参考文献：Genome editing abrogates angiogenesis in vivo (DOI:10.1038/s41467-017-00140-3)

5  攻克HIV，CRISPR立下一功

研究已经发现，携有CCR5纯合突变的人可抑制HIV侵入免疫细胞。而研究者邓宏魁教授则利用CRISPR破坏了CD34+HSPC细胞中的CCR5基因，且其基因编辑效率为21%~28%，显著高于ZFN的编辑效率（17%）。

研究者还将敲除CCR5的细胞移植到小鼠体内后，接触HIV毒株，发现相比于携带正常人HSPC细胞的小鼠而言，HIV RNA水平在感染的最初几周内发生下降，且CD4+T细胞数量下降得更少。

参考文献：CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo (doi:10.1016/j.ymthe.2017.04.027)

不务正业？CRISPR的另类画风

如果你以为CRISPR只能作基因编辑，那么未免有些小瞧了它。都说能者多劳，这不CRISPR已经再像多媒体领域进军啦。

1  魔剪亲自化身“录音机”