突变实验结果阴性怎么办？看看科学家如何“甩锅”！细胞|研究|体细胞

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Sci Rep 2019；9(1)：20158. doi: 10.1038/s41598-019-56618-1
编者语
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是由吸烟引起的。肺癌和烟草的关系早已明确。 COPD和肺癌，早被认为可以“相得益彰” ，共同演变，协同进展，如：呼吸系统细胞线粒体活性氧负荷增加、气道平滑肌细胞突变增加、DNA修复基因下调等。那么， COPD患者气道内是否有更多突变呢？相信很多医生都宁信其有。可在循证医学的导引下，要拿出证据，还是需要下一番功夫的。一群来自西班牙、德国等国的17位科学家，提出一个大胆的假设，并加以科学验证。
接下来我们来看看这些科学家们是
如何逐层递进验证这些假设的？
01
提出假设
假设癌细胞在受影响的组织中携带更多的突变。于是从健康的从未吸烟者和戒烟者（n = 8）以及不同程度COPD的戒烟者（n = 4），通过气道刷检获取样本组织检测体细胞突变情况。希望能够为今后证明“呼吸道细胞突变负荷的增加可能会增加损害细胞周期控制基因的发生风险，并最终将细胞转化为具有发展支气管癌倾向的恶性克隆”提供先决条件，那就是COPD患者的气道中有更多的细胞突变。
02
方法
首先，招募了12位受试者，特征见表1 。
表 1

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Case：COPD患者；FS：已戒烟者；NS：从未吸烟者；受试者1-9在研究的第1阶段招募，只收集1个肺刷样本，受试者10-12随后加入，每人提供2个肺刷样本。所有受试者，在过去的2y里，无一吸烟。
随后进行了样品制备和全基因组测序。
然后进入本次研究的核心部分：体细胞突变警示策略（Strategy of Somatic Mutation Calling）的构建。形象说，即使用一个计算模型，用于提醒突变的程度，加以警示，而那些程度的突变则不用警示。
科学家们在排除存在大量拷贝数改变（倍性与2的偏差）后，用对照FREEC 对处理过的序列数据文件（BAM格式）进行SMC（Somatic Mutation Calling）。他们应用了3种当下最流行的治疗癌症的SMC工具：MuTect、v.1.1.4 22、Strelka、v.1.0.14 23和VarScan 2、v.2.3.2 24 ，只专注于体细胞突变警示（SSM calling）。这3种工具并不是独立地针对参考基因组调用受影响组织和参考组织中的变体，而是同时处理2个给定组织的测序数据。
之后，科学家们将自己得出一套评估策略，试着应用于髓母细胞瘤（MB）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）病例标本，来验证这套策略是否可行。
我们也一起看看结果如何？
作者观察到3种SMC工具的个别结果之间存在很大差异。 VarScan 2和MuTect在每个个体的肺下叶刷样中都显示了2 800多个SSMs ，而Strelka的未筛选结果则小了一个数量级。 3种工具交叉重叠得很少，仅有受试者10是交叉结果中唯一明显增加SSM数量的个体（图1）。另外，无论是COPD患者，还是肺功能正常的戒烟者，与从不吸烟者相比，都没有明确显示突变警示有数量上的增加。因此认为，两组既往吸烟者（有或无COPD）和从未吸烟者之间在由最新的SMC工具提示的总躯体变异负担方面没有明显差异（表2）。
图1 每个受试者下叶支气管刷毛中的体细胞单核苷酸突变（SSM）调用次数
数字表示3个体细胞突变调用工具的交叉结果；蓝色代表COPD患者（深色）、不吸烟者（蓝色）和从不吸烟者（浅色）。
表 2

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COPD患者和对照组肺叶刷检中每Mb的体细胞单核苷酸突变次数。基因组大小根据参考组织和受影响组织中读取深度≥10的位置计算。由于每个类别的个体数量很少，所以给出了范围。分页标题
尽管SMC策略在一些癌症病例中得到了成功的验证，但本次研究还进一步评估了所有受试者下叶刷检标本中1 651个SSMs的一些特征，并将它们与应用相同工具时2个癌症病例中的（真阳性和假阳性）警示进行了比较。在染色体分布、结构注释、与DHS重叠或重复区域以及突变类型等方面，这些警示未显示出实质性差异（图2）。

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图2 EvA研究（N = 12）受试者肺刷和2例癌症患者肿瘤组织中基于同一警示过程的体细胞单核苷酸突变特征
覆盖率和vaf基于Strelka结果。 MB = 髓母细胞瘤；CLL = 慢性淋巴细胞白血病；DHS = DNA酶I超敏位点；IQR = 四分位区间；VAF = 变异等位基因频率。
总的来说，许多位置的VAF结果不支持个体刷毛中存在变异的等位基因，这表明基于WGS的SMC结果中存在相当多的假阳性警示（表3）。
表 3

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选定的体细胞单核苷酸突变（SSM）呼叫的验证分析，按置信类别分层。 85个SSM呼叫中只有一个被确认。
总之，验证分析只能确定一个预测的SSM 。推断这一结果将使我们在1 651个呼叫中只剩下少数正确的SSM ，剩下的99%可能是误报。只有在序列覆盖率、区域复杂性和与多态性数据库重叠方面的严格要求得到满足时，才保证对常见SMC工具的重叠输出具有高度的信心。
03
讨论
在先前有研究中，通过中等深度测序，可在健康组织中的大量体细胞突变称为突变。因此，本研究的科学家们，应用了一种类似的方法，在COPD病例和对照组的气道刷毛中，使用全基因组调用SSMs ，来看看有没有差别。虽然例数很少，仅能算个预实验，但是他们的“科学假设” ，听起来还是很有道理的， ------在以前的对照组和从未吸烟的对照组之间至少检测到不同的数字。然并卵，在这项研究中，他们并未检测出大量的SSMs 。
作为阴性结果的论文， “讨论”理所当然地成为最精彩的部分（你们不解释清楚，人家凭啥给发表呢？）
首先，科学家们寻找证据，来解释这一观察结果。他们推测，戒烟多年后，对强变异肺祖细胞的阴性选择，最终导致既往吸烟者和非吸烟者之间变异水平的协调。然而，有令人信服的证据表明，既往吸烟者气道中积累了更多的突变。首先，在选定的染色体位点上，对吸烟者序列不稳定性的研究，支持这样的观点。其次，与从不吸烟者相比，（现在和以前）吸烟者肿瘤的突变负荷明显增加。再者，在流行病学研究中，戒烟者患肺癌的风险从来没有恢复到从不吸烟者的水平。此外，在刷状标本的气道上皮细胞中未能检测到有意义的突变标记，可能与其组织的可用性不匹配。
（读到这里，笔者想问，科学家们是要“甩锅”给检测技术吗？那好，大家就一起看看“甩锅”喽。但在甩锅之前，科学家们计算工具，又做了一次检查。）
在这项研究中，出现大量的假阴性。不可否认，从不同调用工具派生的交叉结果容易导致许多假否定。然而，在前期研究以及我们对癌症数据的验证中，所有3个呼叫者都显示出合理的敏感性（计算工具们表示：这个锅我们不背）。
在大量样本中，在特定位置检测变异等位基因的能力取决于支持该变异的读取比例。这一比例与携带变异等位基因的细胞数量与细胞总数有关。它可靠地调用变异等位基因的存在所需的最小值，也根据该位置的可用读取深度而变化（图3）。

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图3 支气管上皮中突变克隆的表达分页标题
彩色圆柱体代表气道上皮中不同的细胞克隆，每个克隆都含有相同的体细胞突变。这种克隆体（在鲑鱼底部的克隆体中显示）可能包含多种细胞类型的混合体，例如分化的分泌细胞（在细胞质中显示为颗粒）、纤毛细胞（在外表面显示为纤毛）和未分化的基底细胞（方形），都位于基底膜上（最底部的线）。这种细胞排列称为假复层柱状上皮，是典型的气道结构。克隆体的大小可能不同，但可能在亚毫米范围内，这比支气管镜检查中使用刷子的直径和长度要小得多（如右图所示）。因此，刷子样本包含许多不同的克隆，携带相同体细胞突变的细胞比例非常小，低于检测限。成功的体细胞突变呼叫需要采样较小的区域（即通过获取携带相同体细胞突变的较高比例的细胞来接近检测限）和/或测序到较高的读取深度（即降低检测限）。
本研究中，观察到的刷片样本中基本上没有任何SSM ，这表明我们的方法有很大的局限性。虽然活检通常起源于1～5 mm的区域（截面），但刷毛的取样面积大于100倍，且粘性较小。假设克隆单位的大小相似，即使是超深测序方法也可能难以弥补这种分辨率的损失。
相比之下，对于出生后出现的SSM ，包括所有与吸烟相关的SSM ，尽管刷式采样很容易执行，但它是一种不充分的检测策略，至少与要求大约30%的采样细胞受到影响的中等覆盖测序相结合。
【突变实验结果阴性怎么办？看看科学家如何“甩锅”！】（读到这里，相信大家明白了， SSM是分子，标本里全部体细胞是分母，如果分母太大，这个分数就无限接近0 。就像你往一碗水里撒勺盐，你的舌头会察觉出咸味。但如果往游泳池里撒勺盐，你的舌头就察觉不出来咸味。至此，科学家们成功甩锅了。）
（虽然是一次“失败”的研究，但科学家们仍然得出一些很有价值的结论，我们看看他们最后怎么写的）
为什么保持正常肺功能的吸烟者比那些出现气流阻塞的人患肺癌的风险更低，这仍然是个谜。在这项工作中，作为一项从突变角度解决这个问题的试点研究，支气管上皮细胞样本中的突变负荷无法准确估计，因为克隆细胞群体的大小低于应用方法的检测限。类似工作的综合结果进一步表明：1. 测序到中间读取深度很少足以说明健康组织样本中的突变负荷；2.由于获得细胞的区域相对较大，支气管镜下的气道刷洗是一种不适当的取样策略，可能无法通过深度测序数据克服；3. 与癌症直接相邻的组织不能作为健康组织的有价值替代物，因为细胞系成分可能与肿瘤更为相似。因此， COPD是否通过体细胞突变的积累和持续影响肺癌风险的问题仍然有待商榷。
本期作者

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武焱旻主任医师
? 徐州市中心医院呼吸内二科主任
? 东南大学硕士生导师
? 中国康复医学会呼吸康复专业委员会呼吸治疗学组委员
? 江苏省中西医结合学会呼吸专业委员会委员
? 江苏省医学会呼吸病学分会呼吸衰竭，重症监护及机械通气学组委员

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李若然医学博士
? 徐州市中心医院呼吸与危重症学科副主任医师
? 江苏省中西医结合学会呼吸系统专业委员会青年委员
本文仅代表作者个人观点
仅供医务人员参考
编辑王文熙 | 责编梁文华、杨子峰