8、020 倍(5 )可以扩增mRNADNA通过凝胶分子筛向正极端移动。
川型：线状;
伸展开环状最慢增加插入片段与载体的接触机会 ， 减少载体自我连接的现象 。
14、PCR技术的原理(1) DNA模板变性(2) DNA模板与引物复性(3) DNA链的延伸15、PCR的过程预变性(Pre-denature ) 90-95 oC下5分钟 ， 模板 DNA双链完全变性成单链 。
变性(denature )双链完全变性成单链复性(anneal ) 37-60 oC下1分钟 ， 引物优先与模板复性 。
引物的浓度高引物的链短 。
延伸(extend ) 72 oC下1-2分钟 ， Taq DNA聚合酶在引物的3 端上加上核苷酸 。
变性进 。

9、入循环重复 94 oC下1分钟 ， 新合成的 DNA双链又变性成单链模板 。
第三章基因的克隆载体并在其中得以无性繁殖或表达有意义的1、载体：在基因工程操作中 ， 携带目的基因、实现目的基因进入受体细胞 蛋白质所采用的一些 DNA分子 。
2、按功能划分： 克隆载体(cloning vector):使目的片段能在细菌细胞中复制的载体 。
表达载体(ex pression vector):使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白质的载体 。
3、基因克隆载体的必备条件： 多克隆位点；能自我复制， 有一个复制起点； 选择性标记；安全 。
DNA分子是否插4、 标记基因的作用：指示外源DNA分子(载体或重组分子)是否进入宿 。

10、主细胞；指示外源 入载体分子形成了重组子 。
这种指示也可以是选择性的 ， 也可以是非选择性的 ， 绝大多数为后者 。
5、 质粒：独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子 。
6、 质粒的空间构型：共价闭合环状DNA（ cccDNA）;
开环DNA（ ocDNA）；线形DNA（ lDNA）7、 质粒空间构型与电泳速率：scDNA最快、L DNA次之、ocDNA最慢 。
8、 质粒的不亲和性（不相容性）：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒 ， 不能同时存在于一个细胞中 ， 这种现 象称为质粒的不亲和性或不相容性 ， 这两种质粒称为不亲和性质粒 ， 组成不亲和性群；而彼此能够共存于一个细胞 中称为亲和性质粒 ， 亲和质粒则属于 。

11、不同的不亲和群 。
9、天然质粒的局限性：分子量大 ， 拷贝数低；筛选标记不理想；单一酶切位点少或无 。
10、质粒载体的构建策略：提高质粒载体的拷贝数；引入多克隆位点 在克隆载体中组装“元件” 。
10、筛选重组子的示意图重点11、a互补：蓝白斑选择原理：X-gal;
P-半乳糖苷酶的显色反应； lacZ的a互补 。
12、穿梭质粒载体：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的 质粒载体 。
13、Ti质粒载体：存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中 ， 诱导冠瘿瘤形成 ， 又称肿瘤诱导质粒 。
14、Ti质粒作为载体的可能性：能够自发地整合到植物的染色体上；能转化多种植物；强启动子。

12、强启动子 ， 能启动外源基因的表达 。
15、天然Ti质粒作载体的缺点：分子量太大（200kb）；限制性酶切位点太多 。
被转化的植物细胞成为肿瘤 ， 不能再分化 。
在大肠杆菌中不 能复制 。
16、Ti质粒的改造：保留T-DNA的转移功能部分（vir基因 ， 左右边界） 。
减少限制性酶切位点 ， 引入单一插入位点 。
取消T-DNA的致瘤基因 ， 使被转化的植物细胞不再成为肿瘤 ， 能正常分化 。
冠瘿碱合成对于植物无意义 。
应剔除掉 。
加入 大肠杆菌的ori和选择标记 。
加上真核生物的转录信号和结束信号以及添加polyA的信号序列 。
17、 Ti载体的类型：共整合载体一一需要同源重组才能插入外源基因；双元载体一既有大肠杆菌复制起点也有 农杆菌 。

13、复制起点 ， 是个穿梭载体 。
18、cos位点：ZDNA两端各有12bp的粘性末端 ， 粘性末端形成的双链区域称为佃、天然几噬菌体作为载体的局限性：A噬菌体的非必需区太长；非必需区段上常用的单一限制酶切点少；选择标记基因少；载体的安全性20、A噬菌体载体的构建：构建策略：删除A噬菌体的非必需区 ， 在这个非必需区内制造限制酶切点 ， 删除酶切点；在非必需区引进选择标记基因 。
建立ZDNA重组分子体外包装系统21、 cosmid载体（粘粒）：一类由人工构建的含有 入噬菌体 DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体 ，cos site carry ing vectors 。
22、酵母人工染色体： YAC的特点 。

14、：（1）只能在酵母细胞中扩增 。
（2）克隆容量大 ， 为 230kb-1700kb 。

来源：(未知)

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标题：基因工程|基因工程总结资料( 二 )