6饶量（Tm值）：40%- 60%, PCRT增的复性温度一般是较低 Tm值减去510度 。
c、3 端要求：3端必须与模板严格互补 ， 不能进行任何修饰 ， 也 不能有形成任何二级结构的可能 。
末位碱基是A时错配的引发效率最 低 ， G C居中间 ， 因此引 。

16、物的3端最好选用A、G C而尽可能避免 连续出现两个以上的Tod、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列 ， 否则会自身折 叠成发夹状结构或引物自身复性 。
e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于 4个连续碱基互补 ，3端不应超过2个 。
f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8个的互补 碱基存在 。
g、5端无严格限制：5末端碱基可以游离 ， 但最好是 G或C,使 PCRT物的末端结合稳定 。
还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等） 堂堂 穹穹根据实验目的选择适当的引物 。
常用引物设计软件如Primer5.0 ,Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置 。
2、耗材：实验所用的接触样品的耗材 。

17、如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPCK浸泡处理 ， 除去RNAB,防止操作过程中RNA 降解 。
然后经高压灭活（灭菌和灭活 DEPC 。
3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酉精、 经DEPCt理并高压的水 。
三、RNA勺提取方法：RT- PCR从细胞分离的RNA勺质量至关重要 ， 包括RNA勺纯度和完 整性 。
RN粉离的最关键因素是尽量减少 RNA1的污染 。
但RNAB活 性非常稳定 ， 分布广泛 ， 除细胞内源性RNAB外 ， 环境中也存在大量 RNABo因此在提取RNA寸 ， 应尽量创造一个无 RNAB的环境 ， 包括 去除外源性RNAB污染和抑制内源性RNAB活性 ， 主要是采用焦碳酸。

18、二乙酯（DEPC去除外源性RNAW,通过RNAB的阻寸蛋白Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫富酸服抑制内源性 RNABoRT- PCR 骤：1、RNA勺提取：2、cDNA勺合成:逆转录体系的组成：DEPC 处理水8ul10mM dNTPs2.5ulRandom primers0.4ulRNasin0.5ul总 RNA2.5 3ug70 c 5min速置冰水中冷却再加：5*逆转录buffer 5ul逆转录酶(M-MLV)1ul(200U)加水至25ul37 C 60min90 c 5min3、PCRT增：50ul PCR体系的组成:10x PCRbuffer5ulMgCl23ul(2.0m 。

19、M)10mMdNTPs1ulsense primer1ul(1umol/l)antisense primer1ul(1umol/l)cDNA1.5ulDEPC 处理水36.7ulTaq 酶0.8ul(2.4U)总体积50ul4、PC皈应条件：94C5min94C1min退火温度40sec72C50sec 2 29 cycles72C7min4C0sec四、PCRM牛的优化：PCRRfe件的优化主要是引物退火温度的调节 ，一般在引物设计软件推荐温度的上下2 C变化寻找最佳退火温度 。
此外Mg4浓度的调节也非常重要 ， 通常最佳浓度为2mMfc右 。
引物和模板的量等 。
五、产物的电泳和结果的测定：根据产物长 。

20、度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶 （不同长度产物所需凝胶浓度）取适量PCRT物 ， 加上样缓冲液充分混合 ， 点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中 ， 10V/cm电泳45 60min 。
成像系统成像分析 。
分离不同大小DNAt段的合适琼脂糖浓度琼脂糖浓度（）线性DNAt段的有效分离范围（kb）0.51300.70.8121.1 0.5101.2 0.4-71.5 0.2-3六、需注意的问题：1、注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人：氯仿、澳化乙锭（EB）、酚、异硫富酸服、紫外线等2、注意避免试剂污染3、始终注意避免RNA1的污染：4、保管好自己专用的试剂 ， 公用试剂保管好 ， 相互协调 ， 注意实验室卫生Real time。

21、PCR 跟 RT-PCRt什么区别关键词：reaj time PCRRT-PCR区别I? 2008-07-23 00:00 来源:丁香园点击次数：4932实时荧光定量PCRM理所谓实时荧光定量PC做术 ， 是指在PC皈应体系中加入荧光基团 ，利用荧光信号积累实时监测整个 PCRffi程 ， 最后通过标准曲线对未知 模板进行定量分析的方法 。
1 .内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测 ， 即PCRIU达平台期后进行检测 ， 而 PCRS过对数期扩增到达平台期时 ， 检测重现性极差 。
同一个模板在 96孔PCFa上做96次重复实验 ， 所得结果有很大差异 ， 因此无法直接 从终点产物量推算出起始模板量 。
加入内标后 ，。

22、可部分消除终产物定 量所造成的不准确性 。
但即使如此 ， 传统的定量方法也都只能算作半 定量、粗略定量的方法 。
2 .实时荧光定量PCRB需内标实时荧光定量PCRK术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限 ，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度 ，并记录在电脑软件之 中 ， 通过对每个样品Ct值的计算 ， 根据标准曲线获得定量结果 。
因 此 ， 实时荧光定量PC就需内标是建立在两个基础之上的：1) Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时 ， 刚刚进入真正的指数扩增期(对数期) ， 此时微小误差尚未放大 ， 因此Ct值的重现性极好 ， 即同 一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增 ， 得到的 Ct值是恒定 的 。

稿源：(未知)

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标题：realtimePCR|realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点( 三 )