1、real-time PCR技术的原理及应用摘要：一、实时荧光定量 PCRM理（一）定义：在PCR5应体系中 加入荧光基团 ， 利用荧光信号累积实时监测整个 PCRS程 ， 最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理1、常规PCRK术：对PCRT增反应的终点产物进行定量和定性分析无法 对起始模板准一、实时荧光定量PC丽理（一）定义：在PC皈应体系中加入荧光基团 ， 利用荧光信号累积实时监测整个PCRS程 ， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分 析的方法 。
（二）实时原理1、常规PCRK术：对PCRT增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量 ， 无法对扩增反应实时检测 。
2、实时定 。

2、量PC敬术：利用荧光信号的变化实时检测 PCFT增反应中每一个循环扩增产物量的变化 ， 通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量?通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析4、几个概念：(1)扩增曲线：黄帮程测元件统壁标扩增循环数(Cycte， 级坐标:荧光atftUUB 。
凿 JWLL每个循环进行一次荧光信号的收集(2)荧光阈值:荧光信号阈值(threshold )工 前15个循环信号作为荧光本底信号baseline .既样本的荧光背景值和阴 性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环 的毅光信号的惊准储差的10倍 手动设置：原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对 。

3、照的黄光最高值,同时要尽 量选择进入指数期的最初阶段 ， 并且保证 回归系数大于099 真正的信号:荧光信号超过域值(3) Ct 值:Ct值的定义：C(f) valueCT值的重现性:织轴：黄光信号量寸与 Replicties横轴m PCR反映循环数CycIe HumberPCR扩增过程中 ， 扩增产物的荧光信号达到设定的阈 值时所经过的扩增循环次数Ct值的特点工相同模板进行9敬扩增 ， 终点处产物量不恒定3-Ct值则极具重现性5、定量原理：理想的PC皈应：X=X o*2n非理想的PCR5应：X=X0 (1+Ex)n :扩增反应的循环次数X :第n次循环后的产物量X 鼠初始模板量Ex :扩增效率5、标准曲 。

4、线模板DNA量越多,荧光达到域值的循环数越少,即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系 ， 通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线 ， 根据样品Ct值,就可以计算出样品中所含的模 板量6、绝对定量1)确定未知样品的C(t)值2)通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA勺荧光标记:非特异性荧光标记：1、SYBR Green特异性荧光标记:、工四Man ， 3、Molecular Beacon二、实时荧光定量PCR勺几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green能结合到双链 DNA勺小沟部位Tm值 ， DNA解链一半时的温度SG SG SG SG Emss 。

5、ionill i iiii fi i II i i i iH in I r f 11 i 111 h 11 mir1 3o.jh .Ullin, mi min11in 1J.UIUJ.1.111UU.M iu_ 引 SG SG SG2、SYBR Green只有和双链DNA吉合后才发荧光3、变性时 ， DN敏链分开 ， 无荧光4、复性和延伸时 ， 形成双链 DNA SYBRGreen发荧光 ， 在此阶段采集荧光信号No EmissionExcitatio模板DNA量越多 ， 荧光达到攵越少9qErw 804)将温度与荧光强度的变化求导 。
（-dl/dT） Log浓度与循环数呈线性关 系 ， 根据样品Ct值.就可以计算PC 。

6、皈应体系的建立及优化1、SYBR Green使用浓度：太高抑制Taq酶活性 ， 太低 ， 荧光信 号太弱 ， 不易检测2、Primer：引物的特异性高 ， 否则扩增有杂带 ， 定量不准3、MgCl册浓度：可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer体系的优化5、反应温度和时间参数：由酶和引物决定6、其他与常规PCN目同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR5应的条件 ， 对常规PCRt指 导意义 ， 如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变 异产物、多种产物 。
（三）优点及缺点优点：对DNAJI板没有选择性；适用于任何 DNA 使用方便；不 必设 。

7、计复杂探针；非常灵敏； 便宜 。
缺点：容易与非特异性双链DNA吉合 ， 产生假阳性；但可以通过 融解曲线的分析 ， 优化反应条件；对引物特异性要求较高 。
方法二：TaqMan-水解型杂交探针Probe Reporter Quencher与目标序列互补,如 FAM VIC 等*5 端标记有报告基团(Reporter, R)*3 端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)*探针完整 ， R所发射的荧光能量被 Q基团吸收 ， 无荧光 ， R与Q分开 ， 发荧光*Taq酶有5 -3外切核酸酶活性 ， 可水解探针(一)工作原理注意：每扩增一条DN粉子 ， 释放一个荧光信号 ， 可以在循环过程中任一点检测荧光PC皈应的建立：1、引物、探针的 。

8、设计:探针Tm为68-70 C , 30 bp, 5 不能有G, G可能会淬灭荧光素,引物尽量靠近探针 ， 扩增片段400 bp,引物Tm为59-60 C2、反应参数的确定：一般为：94 C, 10-20S60 C, 30-60S （Taq酶5 3外切核酸酶活性在60c最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 C, 45 S,3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值 ， 信号/背景比值的最大引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCRlf同（二）优缺点优点：对目标序列的高特异性-阴性结果确定设计相对简单- 与目标序列某一区域互补重复性比较好缺点：只适合一个特定的目标；委托公 。

稿源：(未知)

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标题：realtimePCR|realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点