来自测量GST 一、测量酶活性的实验注意事项( 二 ) _做好westernblot需要注意各种细节，转给需要的你！

1.配制8ml 10%分离胶，依次向小烧杯中加入蒸馏水3.04ml，30%丙烯酰胺2.7ml，1.5M?pH8.8 2.0ml，10%SDS 80ul，10%AP 80ul，TEMED 3.2ul 。加入TEMED混匀后立即灌胶，用1ml枪头沿着玻板上沿从左至右轻轻将胶打入，以免胶浓度不均匀，避免气泡产生。加完后换200ml枪头从左至右更加小心加入蒸馏水水封，以免冲散刚灌的分离胶。静置，当水和胶之间出现一条水平的折线时，即已凝固。
2.待分离胶凝固后，将水封的蒸馏水倒出，可将滤纸条放于玻板角吸水加快残留水流出，倒置。配制4ml 5%分离胶，依次向小烧杯中加入蒸馏水2.7ml，30%丙烯酰胺670ml，0.5M?pH8.8 500ul，10%SDS 40ul，10%AP 40ul，TEMED 4ul 。加入TEMED混匀后立即灌胶，同上用1ml枪头从左至右轻轻加入浓缩胶，加满后冲洗10孔梳子，水平轻轻插入浓缩胶中静置待其凝固。可将剩余的浓缩胶沿着梳子加入玻板中以完全密封。
3.此时，可将之前分装好的煮过的加入loading buffer的蛋白样品、预染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置于4℃融化。
Little Trick
1.AP和TEMED均为神经毒性、致癌物质，使用时需小心。
2.灌胶时视线与胶面水平，注意操作，避免胶溅入眼睛中。
3.常温下半小时胶可凝固，若天气寒冷或需加快凝固，可将其置于37℃孵箱中，15min左右即可凝固。
4.若第二天早上立即跑胶，这样就不耽误午饭时间，可头天晚上先把胶配好，凝固后取下玻板，连夹子、梳子一同放入蒸馏水中，4℃过夜保存。
1.将玻板卡紧电泳槽中，先在内槽加满已配好的1×电转液，十几分钟后观察是否漏液，若漏液重新调整玻板，再次卡紧，直至不漏液为止。否则，可能胶还没跑完，电转液就漏完了。
2.轻轻拔去梳子，第一孔加入5ul预染的蛋白maker，2~7孔依次加入20ul待测蛋白样品，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer 。上样时轻轻加入，注意不要将样品加入其他孔，或加样过快导致样品溢出。
3.插好正负极，注意检查正负极不能插反。调节电压至80V（浓缩胶），跑0.5h后；将电压调至100V（分离胶），约1.5h后，maker分离明显，在胶底部出现一条蓝色的buffer条带，此时电泳完毕。使用完在实验仪器使用本上做好登记。
注意：避免蓝色条带跑出分离胶，这样有可能目的蛋白也已经跑出，所以在分离胶底部出现一条整齐水平的蓝色条带时，即停止电泳。
Little Trick
1.电泳时插好正负极后，从电泳槽底会有小气泡上升，气泡的数目和上升速率与电压大小呈正比。若小气泡和往常不太一样，观察几分钟后还是如此，则需检查是否加错了电泳液，或者电泳液配制有误。
2.一般浓缩胶80V 0.5h，分离胶100~120V 1~1.5h，具体跑胶电压和时间与目的蛋白大小、实验仪器和实验室环境都有关，需多次探索最佳条件。若目的蛋白较小，则尽量缩短跑胶时间，并及时观察maker位置，避免目的蛋白跑出。我分别实验了浓缩胶80V 0.5h，80V 1h，分离胶120V 1.5h，120V 1h，100V 1.5h，100V 1h，110V 1.5h，110V 1h，结果显示在本实验室实验仪器下，我的目的蛋白及内参在浓缩胶80V 0.5h，分离胶100V 1.5h条件下，分离效果最好。在此条件下，我做了几次重复实验，结果均一致。因此，总结出本实验室此目的蛋白的最佳电泳条件。
3.电泳的好坏直接影响到目的蛋白的显影情况，尤其时磷酸化目的蛋白的二聚体，若电泳条件优化，结果可清晰显出蛋白表达情况。所以探索最佳电泳条件是决定胜负关键一步。
4.电泳快结束时即可准备转膜所需的滤纸和PVDF膜，浸泡在电转液中。建议在第一次WB后分别剪好不同大小的硬纸片，标好面积和孔数（即样品数），存好以后随时使用。
5.WB中夹取PVDF膜最好使用平头镊子，并夹住膜左上角，可最大程度减小对膜上蛋白的损害。
电泳结束后，取出玻璃板，稍微冲洗，洗净电泳槽，放好。轻轻撬开玻璃板，根据maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切胶，为了防止切歪，可在玻璃板下垫上上述剪好的同切胶大小一致的硬纸片。一般一块胶需切下目的蛋白和内参两小块胶，将切下的胶分别浸泡在电转液中。
1.根据每一块切胶的大小剪6张同样大小的滤纸和一张PVDF膜，浸泡于电转液中，可以提前准备好的硬纸片为模板剪。PVDF膜先经甲醇活化20s后浸泡于电转液中。
2.在电转仪上制作“三明治”结构转移膜，最下面放三层滤纸，然后依次放PVDF膜，胶，三层滤纸，用玻璃棒轻轻赶走气泡（注意上下三层滤纸之间不能接触，否则易造成短路）。盖上盖子，根据膜的总面积调整电流，电转2h 。