来自测量GST 一、测量酶活性的实验注意事项( 六 ) _做好westernblot需要注意各种细节，转给需要的你！

1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本
2）以上未列的其它不当样本
（六）核酸提取
RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp® 病毒RNA提取试剂盒，RNeasy®小试剂盒 (QIAGEN公司)，罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA 。
（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。
二、实验材料
（一）试剂
1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；
2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；
3、正反向引物 (40μM)；
4、双重标记探针(10μM)；
5、阳性对照。
（二）供给
1、实验室标记笔；
2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管；
3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头；
4、0.2ml PCR 反应管盘；
5、光学反应盖板；
6、无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管；
7、一次性无粉手套。
（三）仪器设备
1. 微量离心机；
2. 漩涡振荡器；
3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。
三、操作程序
（一）准备工作
1. 避免样品污染
由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：
1）实验准备与核酸提取使用独立区域；
2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；
3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；
4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；
5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。
2、仪器准备
工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzap”或者“RNase AWAY®”来减小核酸交叉污染的风险。
3、试剂准备
注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。
1）引物和探针
（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；
（2）涡旋振荡引物和探针；
（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。
2）Real time RT-PCR的试剂
（1）将Master Mix和酶置于冰架上；
（2）融化2×的Reaction Mix；
（3）颠倒混合2×的Reaction Mix；
（4）瞬时离心2×的Reaction Mix和酶，置于冰架上。
4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测
1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP) 。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。
2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。
3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。
5、建立反应
反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。
1）为每一个引物和探针标记一个1.5ml的微量离心管；
2）对每一个建立的反应确定反应数（N）。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2 。
3）Master Mix:计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。计算如下：
* 体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
4）加入水之后，通过上下吹打混匀反应混合物，不要涡旋振荡。
5）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；
6）准备板状的反应管子或者96孔板，置于冰架上；
7）每一个master mix吸取20μl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图：
实验建立举例：
实验样本举例：
注意：在任何样本被加入之前，应该首先加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检验master mix中的污染。HSC应该在待测样本之后加入（第11列），用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照（PTC）应该在所有样品和阴性模板对照（NTC）之后被加入。