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ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)是美国National Institutes of Health (NIH)开发的基于Java的免费公共图像处理软件，在生物及医学图像分析中起着非常重要的作用。
ImageJ可在一个窗口中显示多个空间或时间相关的图像，这些图像集称为图像栈（Stack），组成Stack的图像称为Slice 。Stack图像是SCI论文中常用的图像类型：
今天半夏给大家分享Stack图形的概念、基本操作与实际应用。
1 Stack图像介绍
数字图像不仅是二维图片或具有多个通道的二维图片， Stack图片具备有三个空间维度：X ， Y和Z 。
Hyperstacks具有四个以上维度，例如X（长）， Y（宽）， Z（片）， C（通道）和t（时间帧）。
下图为ImageJ官网示例Stack图片t1-head.tiff ， 2维图像（XY视图）窗口如左侧窗口（256 x256），当前Slice为129张图片的第58张。t1-head.tiff图片属性如右图所示：
共聚焦图片Z-Stack层扫可以得到Stack或Hyperstacks图片，下图为共聚焦系列图片，该图片包含红、绿两通道以及Z轴25张切片：
图片属性可通过Image -> Properties得到：
2 如何显示Stack图片中的所有切片？
Make Montage可以得到一个单一图片，该图片包含Stack图片中的所有图像，步骤为：
Image -> Stacks -> Make Montage 。Make Montage命令窗口可以通过Columns与Rows设置产生图片的布局（下图为7列3行），选择制作Montage切片的范围（First Slice ， Last Slice）等：
下图是SCI文章中的Montage图：
反之， Montage图也可以转换成Stack图。方法为：
Image -> Stacks -> Tools -> Montage to Stack 。
3
Stack图像Orthogonal Views（正交视图）
正交视图除显示Stack图像的XY视图外，还可显示XZ、YZ投影图像。XZ、YZ投影图像显示在原始图像的旁边：
步骤为Image -> Stacks -> Orthogonal Views 。鼠标点击位置为三个视图的交点，交点可在XY、XZ与YZ视图中显示，可以拖动鼠标来控制交点位置：
拓展：正交视图的应用
正交视图在SCI论文中常用来显示三维共定位，下图层扫共聚焦图片通过正交视图可显示BrdU与GAD在三维空间中存在共定位：
正交视图实际上仅能提供来自不同角度的临时数据，如何得到上述SCI论文中显示的图片？
以confocal-series.tif图像为例，步骤如下：
1、 ImageJ软件打开confocal-series.tif ， Image -> Color -> Stack to RGB将多通道图片转变为RGB图片，此时confocal-series.tif为RGB图片且包含多张切片：
2、正交视图：Image -> Stacks -> Orthogonal Views
3、保存XY、XZ与YZ视图
XZ、YZ视图直接通过File -> Save as tiff：
XY视图保存：
XY视图保存需要将不同切片进行Z方向投影，方法为Image -> Stacks -> Z projection…
Z projection功能支持6种不同的投影方式：
Average Intensity ，均值投影，每个图像的像素是Stack图像中所有图像在相应位置像素的均值。
Max/Min Intensity ，最大/最小投影，图像中每个像素是Stack图像中相同位置所有图像中的最大/最小值。
Sum Slices ， Stack图像的总和。
Standard Deviation ，所有切片的标准差。
Median ，中值投影输出的图像，图像中每个像素是Stack图像中在相应位置像素的中值。
在此我们选择Max Intensity ，得到XY视图：
File -> Save as tiff即可。
4、打开PhotoShop（PS），打开保存好的XY、XZ与YZ视图：
使用直线工具在各视图中画直线：
得到SCI文献中三维共定位正交视图：
拓展：
Z projection可将共聚焦层扫图片进行最大密度投影得到清晰的图像，例如具备突起的细胞。左侧为Stack图片，右侧为经过Z projection最大密度投影的图片，最大密度投影的图片可以完整的显示星形胶质细胞的突起：
4 Stack图像3D投影
3D投影是用来创建一个沿着（X、Y或Z轴）旋转的投影，该投影具有三维效果。
步骤为：Image -> Stacks -> 3D Projection…