「重庆医学」关键发现！新冠肺炎治愈后核酸阴性患者外周血存在变异淋巴细胞( 二 ) 齐

1.资料与方法：
1.1一般资料选取重庆市长寿区人民医院收治的20例新型冠状病毒肺炎患者（2020-01-18至2020-3-15），经过治疗后达到出院标准并出院接受隔离观察，其中11例患者在隔离观察期间复查新型冠状病毒核酸呈阳性，此为复阳组，其中男3例，女8例，年龄为39~70岁，平均（50.8±12.33）岁；另外9例在隔离观察期间复查病毒未见阳性，此为阴性组，其中男3例，女6例，年龄为12~68岁，平均（50.65±15.33）岁。两组均要排除合并或既往患有血液系统疾病或恶性肿瘤等可引起外周血有核细胞形态数量明显改变的疾患；排除3个月内用过可使血细胞形态明显改变药物的患者。
1.2仪器与试剂流式细胞仪为中国深圳迈瑞科技有限公司，型号BriCyteE6；CD3/CD16+56/CD45/CD19检测试剂和CD3/CD8/CD45/CD4检测试剂（流式细胞法-FITC/PE/PerCP/APC）。
1.3淋巴细胞亚群检验方法采集患者EDTA-2K抗凝的静脉血2ml作为检测样本。取两支试管，其中一支试管加入20μLCD3/CD8/CD45/CD4四色试剂，标记为“T” ，另一支试管中加入20μLCD3/CD16+56/CD45/CD19四色试剂，标记为“BNK”；各取50μL样本分别加入两支试管底部，混匀，室温（20℃-25℃）避光孵育15min；分别向两支试管中加入450μL1X溶血素，混匀，室温（20℃-25℃）避光孵育5-10min ，上机检测。
1.4细胞形态检测方法用真空采血管法采集患者静脉血2ml于EDTA-2K抗凝剂的采血管内并充分混匀，实验室人员经充分且必要的防护后于生物安全柜内制备成血涂片，血涂片符合《全国临床检验操作规程》的要求。血涂片自然风干并于生物安全柜内紫外线灭活可能存在的病毒[2]后经瑞氏-姬姆萨染色液染色，用CX41OLYMPUS双目光学显微镜油镜镜检分类[3] 。油镜下分类计数100个有核细胞，三人分类镜检，特征性细胞必须经三人一致认可。每个患者血片三人分别分类计数求其平均值。并认真观察各种细胞的细胞形态和分布情况，保留图片，统计分析数据。
1.5观察指标流式细胞法主要研究外周血淋巴细胞亚群流式细胞表达结果；血细胞形态主要观察变异的淋巴细胞；如花瓣样淋巴细胞、蝴蝶样淋巴细胞、不规则样淋巴细胞形态及数量。
1.6统计学处理用SPSS25.0软件进行统计学分析。正态及近似正态分布的数据以‘x±s’表示，两组间均数比较使用两独立样本t检验， P<0.05表示差异有统计学意义。
2.结果
2.1COVID-19治愈出院后核酸复阳组与阴性组外周血淋巴细胞亚群流式细胞结果对比分析
如表1所示，复阳组的淋巴细胞亚群L#、T#、CD4-T#、CD8-T#、B#、NK#与阴性组中的淋巴细胞淋巴细胞亚群绝对值对比，其T#和CD4-T# ，经t检验P>0.05 ，无显著性差异；其L#、CD8-T#、B# ，经t检验P<0.05 ，有显著性差异；NK# ，经t检验P<0.01 ，有非常显著性差异。
表1COVID-19治愈出院后复阳组与阴性组外周血淋巴细胞亚群流式细胞结果对比分析（/μL,x±s）

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2.2COVID-19治愈出院后复查阳组与阴性组外周血变异淋巴细胞对比分析
如表2所示，复阳组变异的淋巴细胞（花瓣样、蝴蝶样和不规则样）与阴性组中变异的淋巴细胞百分比，其均数低于复阳组，且经t检验P<0.01 ，具有非常显著性差异。
表2COVID-19治愈出院后复查阳组与阴性组外周血变异淋巴细胞对比分析（%,x±s）

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2.3COVID-19恢复期阴性组患者外周血变异淋巴细胞的形态（花瓣样）
阴性组变异花瓣样淋巴细胞其形态见图1 。其花瓣样变异淋巴细胞形态特点为：胞体较大略为红细胞的2-3倍，呈圆形或卵圆形，其胞核浆比大小不一，核呈花瓣样分叶状，其分4叶见图1-3 ，分6叶见图1-1、图1-2 ，染色质着色变浅呈粗块状样，胞浆淡蓝染，部分细胞可见粗大紫色颗粒见图1-2、图1-3（10×100）。