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今天是最后一题了，照例回顾一下作业：

模仿文献，用R语言作箱线图，PMID: 26559812，Fig 1B

用RTCGAToolbox包下载结肠癌的mRNAArray的数据，肿瘤类型代号：COAD；版本号：20140115；基因：IL17A。

图中所标的P值的获取方法在课件中没介绍，暂时不用做。

有兴趣的小伙伴还可以试试该文补充材料的FigS1，即同一套数据的RORC基因。

这题用R语言可能对部分小伙伴来说有点难，但由于在R里下载数据，跟后续很多种分析都能轻松对接，所以我还是希望大家能通过这题作业先熟悉R的下载和简单作图。

RTCGAToolbox这个包对windows不太兼容，开发组也一直致力于改进这些问题。而从生信研究人员们的反映来看，它是TCGA相关的包里相对比较稳定的了。而且……给大家写这段代码的老师据说是用Mac电脑，所以之前没碰到这么多妖蛾子@_@这回为了在windows上找到各种问题的解决办法也花了不少力气。我也用windows，我行你肯定也行~

步骤

加载RTCGAToolbox包，用getFirehoseData()按题目要求下载数据，储存在Data中。

课件中还有个clinical参数，但默认是下载（TRUE）的，没特别需求我就不写了，让它默认吧。当下载遇到提示“path too long

”

的时候，便去解压mRNAArray文件，找到名字长的那个，改成“20140115-COAD-1.txt”，回到R中再次运行上边那行命令。

这样便下载好了，接下来做箱线图。

课件中给了一大段命令，这段几乎可以当成祖传代码了~

写的时候把里面的PIK3CA都换成IL17A。如果你原来写好了这段命令就更简单了，在RStudio中按Ctrl + F，在上方的搜索栏里搜PIK3CA，点Replace替换成IL17A，或者点旁边的All全部替换也一样的。

替换完成后运行，就得到了一张图：

这里面老师已经把颜色、坐标轴、标题啥的都给咱们设好了。要模仿得更像文章里的图的话，就再改一下最后boxplot那句：

就是肿瘤组和正常组换个位置，ylab是Y坐标轴的标题，names是每个箱子的名字，按顺序填好，删掉颜色。再运行就得到了这样的图，调整一下窗口大小，图也就跟着调整了：

接下来，图上方的Export可以将图片导出成PDF或图像。

若上方点选了Image，则还可在弹窗中选择其他格式，SVG、EPS都是受杂志欢迎的矢量图。这样可以转到Adobe Illustrator中跟其他来源的图片拼成一张Figure。

关于纵坐标轴标签

教程里标记的是“mRNAArray”，文献里标记的是“Normalized IL17A expression”，可以说，后者会更加贴切，原因是我们拿到的TCGA数据，都是经过了标准化处理的。本例中，mRNAArray的数据是经过Lowess标准化（normalization）的。还记得上边关于提示“Path too long”的处理步骤吗？其中提到要解压一个压缩文件，而解压后的文件夹，名字超长的，这个名字里就有数据标准化方法的信息（见下图）。

关于分组

TCGA对样本的分组信息，是隐藏在样本的编号里的。TCGA样本编号解读：

图片来源于http://wiki.nci.nih.gov/display/TCGA/TCGA+barcode

其中第一个粉红色框中的数字便是区分肿瘤和正常的编码，01-09为tumor，10-19为normal，所以我们的教程中就有了这一段命令：

sampleIDs1 < 20且>9则提取出来命名为normalSample组，<10则命名为tumorSample组。

而这两句之前的一段for循环程序，则是为了把粉红框里的数字提取出来，转换为数字类型（原本是字符串），这才能通过比较大小来分组。

稍后我们还会推出视频教程，进一步教授大家使用R语言分析TCGA数据的操作，届时会详细讲解代码的意义，这里就先不展开了。

关于P值

下面讲讲作业中没要求大家做的P值，

文章中基因差异分析是用经验贝叶斯方法（empiracal Bayes）。课件中所用的基因表达差异分析函数，getDiffExpressedGenes()，其实也是用的这个方法，但它将分析过程和全部基因的结果隐藏在内部，然后再根据我们设置的条件，把符合条件的结果展示出来。

当我们用getDiffExpressedGenes()函数分析基因差异时，目的是找到具有统计学意义的差异表达基因，因此我们设置了几个阈值（比如，限定了p值<0.05，限定了logFC=2），符合我们设置的这些阈值的基因才会被筛选出来，不符合阈值条件的基因就会被过滤掉。

而当我们的目的是计算某个基因的p值时，我们需要修改一下思路。原因是我们需要计算p值的这个基因，它的表达情况可能因为不符合我们设置的阈值而没有被筛选出来，因此，我们可以不设定阈值，即获取所有基因的数据，然后从这些数据里找到我们需要的这个基因的数据。

将getDiffExpressedGenes()函数的参数重新设置一下，不定义筛选阈值：

注意，不定义筛选阈值

≠

不填参数，因为如果不填，系统就会按默认值筛选（比如logFC，默认值是2）。这里把logFC设为0，意即显示变化倍数大于2的0次方=1，其实就是不管有没有变化，都要呈现出来；P值设为1，即p值在1以下的结果都呈现出来，也就是给出所有结果。

随后，将这些结果赋值给“DG”对象。

在RStudio中点开DG，便可以看到，结果中包含了17814个基因的分析数据：

在DG这个数据框里，每一行的行名就是基因名，所以可以通过提取DG的某一行结果，达到显示我们感兴趣基因的分析结果的目的：

文献中的p值是0.01，显然作者用的是未校正的P值（见图中红框）。

需要注意的是，

getDiffExpressedGenes()只能分析RTCGAToolbox下载的数据，用其他来源的数据可能会报错的。

最后可以在boxplot()后面加一行text()，把P值填到图上。

0.7和1.9是自己从图上估摸的坐标位置，后面P = 0.01是将要写上的文字。这句写不写都行，反正你极有可能是要跟其他图片一起放到

Adobe Illustrator等

软件中排版的，到时候再加上也方便。

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