1、叶绿体DNA的提取（参考杜氏盐藻）1、材料：扁藻2、培养基配方：3、仪器：超速离心机 细胞破碎仪4、用于细胞破碎和叶绿体分离的缓冲液：溶液1：0.33 mol/L山梨糖醇Sorbitol ， 50m mol/L Hepes, 2m mol/LEDTA, 1m mol/L MnCl2, 2m mol/L DTT,体积分数0.5%BSA ， Leupeptin 1mg/L溶液2（45%蔗糖加离心缓冲液）：45g/L蔗糖 ， 0.33mol/L Sorbitol ， 50m mol/L Hepes溶液3（60%蔗糖加离心缓冲液）：60g/L蔗糖 ， 0.33mol/L Sorbitol ， 50m mol/L Hepes溶 。

2、液4（叶绿体洗涤缓冲液）：0.33mol/L Sorbitol ， 25m mol/L Hepes以上缓冲液均用KOH调pH至7.5溶液5： 50m mol/L Tris-HCl ， 100 m mol/L EDTA ， pH8.05、完整叶绿体的分离（所有操作均在4进行）1）将培养10d左右达对数生长后期的250ml藻液 ， 离心收集藻体 ， 液氮充分研磨后 ， 将上述藻体细胞用20ml冰预冷的溶液1充分缓慢的悬浮于50ml离心管 ， 制成（粗体液） 。
3）将粗体液于1000g离心30s ， 弃上清 。
4） 再次用10ml冰预冷的溶液1充分缓慢悬浮 ， 悬浮液平均铺满于6个10 mL HITACHI CPIO0专用离心管上层 ， 每个 。

3、离心管最下层铺有冰预冷的3 mL溶液3 ， 其上铺有冰预冷的3 mL溶液2形成梯度 。
5）4,40 000 g离心3h ， 完整的叶绿体集中在梯度之间 ， 将此层小心吸至10 mL离心管(约2 mL)6）加入4倍体积的冰预冷的溶液4 ， 3 000 g离心5min以除去多余的蔗糖 ， 重复此步骤1次 。
7）将沉淀悬浮于3 mL溶液4作为完整叶绿体制品 ， 置于4 备用 。
6、cpDNA的提取及鉴定 l）在得到的新鲜完整叶绿体制品中 ， 加入终浓度分别为150g/l和13mmol/l的DNase I和MgCl2 ， 并于冰上静置2h以去除来自核DNA的潜在污染2）4,1 000 g离心1 min ， 收集叶绿体沉淀3）将叶绿体沉淀悬浮于 。

【叶绿体|叶绿体DNA的提取-微藻】4、500l 溶液5 ， 加入终浓度为2%的SDS (初始浓度为20%的SDS加55l) 和终浓度为100g/ml的蛋白酶K（初始浓度为20mg/ml ， 加2.7l） ， 55水浴3h；4）、加入等体积的饱和酚(pH8.0) ， 轻轻混合均匀 ， 于4 ， 12000rpm离心10-15min5）小心移取上清于新的灭菌EP管 ， 后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） ， 混匀 ， 于4 ， 12000rpm离心10-15min；6） 小心移取上清于另一离心管 ， 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1） ， 上下颠倒混合均匀 ， 于4 ， 12000rpm离心10-15min；7） 移取上清 ， 加1/10体积的3M NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇（-20） ， 于-20冰箱中沉淀过夜或-80沉淀1h；8） 4 ， 10000rpm离心15min ， 弃上清；9） 加入70%酒精 ， 10000rpm离心10分钟 ， 洗涤沉淀两次；10） 将沉淀于室温放置 ， 直至无酒精气味 ， 加30-50lTE缓冲液或RNase-free水溶解沉淀 。

来源：(未知)

【学习资料】网址：/a/2021/0322/0021748029.html

标题：叶绿体|叶绿体DNA的提取-微藻