1、第一章第一章 血液标本采集与处理血液标本采集与处理 临床免疫学检验技术 第六章第六章 免疫沉淀试免疫沉淀试 验验 秦 雪 目录目录 第一节 免疫沉淀试验的基本原理 第二节 液相免疫沉淀试验 第三节 凝胶内免疫沉淀试验 第四节 免疫沉淀试验的临床应用 第五节 临床常用免疫沉淀试验试剂方法特点 第六节 影响免疫沉淀试验的主要因素 第一节第一节 免疫沉淀试验的基本原理免疫沉淀试验的基本原理 一 二 三免疫沉淀试验的特点 免疫沉淀试验的分类 基本原理 第一节第一节 免疫沉淀试验的基本原理免疫沉淀试验的基本原理 一一、基本原理：、基本原理： 沉淀反应沉淀反应 将可溶性抗原与相应抗体置于温度、酸碱度适宜的 。

2、一 定电解质溶液中 ， 两者按适当比例形成肉眼可见的沉淀线 或沉淀环 ， 并根据所形成的沉淀物计算待测抗原或抗体的 含量 。
二、免疫沉淀试验的分类二、免疫沉淀试验的分类 液相沉淀试验液相沉淀试验 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 环状免疫沉淀试验 絮状免疫沉淀试验 透射免疫比浊试验 散射免疫比浊试验 免疫扩散试验 免疫电泳技术 第一节第一节 免疫沉淀试验的基本原理免疫沉淀试验的基本原理 三、免疫沉淀试验的特点三、免疫沉淀试验的特点 1.阶段性 免疫沉淀试验分两个阶段 ， 第一阶段为抗 原抗体特异性结合 ， 形成不可见的可溶性免疫复合物；第 二阶段则形成可见的免疫复合物 。
2.特异性 免疫沉淀试验为抗原与相应抗体发 。

3、生特异 性结合反应的过程 ， 因此具有特异性 。
3.抗原性质 参与免疫沉淀试验的抗原必须为可溶性 抗原 。
4.抗体的选择 多克隆抗体与抗原多个表位结合 ， 易 形成沉淀 ， 故非常适用于免疫沉淀试验；单克隆抗体只与 抗原一个表位结合 ， 不易形成交联 。
若抗原表面有两个以 上相同的表位 ， 单克隆抗体也可用于免疫沉淀试验 。
第一节第一节 免疫沉淀试验的基本原理免疫沉淀试验的基本原理 第二节第二节 液相免疫沉淀试验液相免疫沉淀试验 一 二 免疫浊度测定 絮状免疫沉淀试验 液液相免疫沉淀试验（相免疫沉淀试验（liquid phase liquid phase immunoprecipitation testimmuno 。

4、precipitation test） 是指可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的液相介 质中反应 ， 形成肉眼可见的沉淀物 。
根据实验方法和所 形成的免疫复合物呈现的沉淀现象的不同 ， 可将液相免 疫沉淀试验分为环状免疫沉淀试验、絮状免疫沉淀试验 和免疫浊度测定 。
第二节第二节 液相免疫沉淀试验液相免疫沉淀试验 一、絮状沉淀试验（一、絮状沉淀试验（flocculationflocculation） 是可溶性抗原与相应抗体特异结合 ， 在电解质存在的 条件下 ， 形成肉眼可见的絮状沉淀物 。
此方法受抗原抗体比例的影响非常明显 ， 常用来作测 定抗原抗体反应的最适比例 。
有抗原稀释法、抗体稀释法和方阵滴定法三种操作方 法 。

5、 。
第二节第二节 液相免疫沉淀试验液相免疫沉淀试验 二、二、 免疫浊度测定（免疫浊度测定（immunoturbidimetryimmunoturbidimetry） 原理：可溶性抗原与相应抗体特异性结合 ， 两者在比 例合适和增浊剂作用下 ， 可快速形成较大的免疫复合物 ，使反应液出现浊度；当反应液中保持抗体过量且浓度固定 时形成的免疫复合物随抗原量增加而增加 ， 反应液的浊度 也随之增加 ， 即待测抗原量与反应液的浊度成正相关；与 标准曲线比较 ， 即可计算出待测抗原的含量 。
第二节第二节 液相免疫沉淀试验液相免疫沉淀试验 （一）透射免疫比浊试验 1.原理 可溶性抗原与相应抗体在一定缓冲液中结合形成免疫复合物 ，。

6、 使反应液浊度发生改变 ， 当一定波长的光线通过反应液时 ， 被其中的 免疫复合物反射、吸收而引起透射光减少 ， 可用吸光度表示 ， 吸光度 与免疫复合物的含量成正比 ， 在保持抗体过量的条件下 ， 吸光度与抗 原量成正比 。
2.方法学评价 （1）优点：操作简便、快速、结果准确性较好、能用全自动或 半自动仪器进行测试、敏感度比单向免疫扩散试验高5倍10倍 。
（2）缺点：1）抗体用量大；2）耗时长；3）抗原或抗体极度 过剩时易导致免疫复合物分离；4）不宜用于药物半抗原的检测 。
第二节第二节 液相免疫沉淀试验液相免疫沉淀试验 （二）散射免疫比浊试验 1原理 利用抗原抗体在液相中特异性结合后产生一定大小的 免疫复合物 ， 当一 。

7、定波长的光通过该反应液遇到免疫复合 物时光线发生散射现象 ， 散射光的强度与免疫复合物的含 量和散射夹角成正比 ， 与入射光波长成反比 。
当散射夹角 和入射光波长一定时 ， 散射光的强度与免疫复合物的含量 成正比 ， 当反应体系中保持抗体过量时 ， 形成的免疫复合 物含量又与抗原含量成正比 。
应用标准品制作标准曲线 ，通过检测散射光强度即可计算出待测标本中的抗原含量 。
根据散射光检测时间及检测方式的不同 ， 散射免疫比浊试 验又分为终点散射比浊试验和速率散射比浊试验两种 。
第二节第二节 液相免疫沉淀试验液相免疫沉淀试验 2.终点散射比浊试验 所谓“终点”是指在抗原抗体反应达到平衡时测定散 射光强度 。
在抗原抗体反应的第一阶 。

8、段 ， 溶液中产生的散 射光信号波动较大 ， 计算出的结果会产生较大的误差 。
散 射免疫比浊试验是避开了抗原抗体反应的不稳定阶段 ， 在 抗原抗体反应的最佳时段读数 ， 将误差降到最低 ， 且必须 在免疫复合物相互聚合形成絮状沉淀前完成测定 ， 否则光 散射值降低 ， 得出偏低的结果 。
终点散射比浊试验是在免 疫反应进行到一定时间时测量其浊度 ， 故亦称定时散射比定时散射比 浊试验浊试验 。
第二节第二节 液相免疫沉淀试验液相免疫沉淀试验 2.终点散射比浊试验 终点散射比浊试验是在抗原抗体反应达到平衡时测定 散射光强度 。
其检测敏感度较高 ， 达g/L水平 ， 高于透射免疫比 浊试验 ， 但低于速率散射比浊试验 ， 可用自动化分析；在 抗原抗体反 。

9、应的第一阶段 ， 反应时间较长 ， 不合快速检测， 计算时需减去本底值 ， 在微量测定时 ， 本底的干扰会影 响准确测定 。
第二节第二节 液相免疫沉淀试验液相免疫沉淀试验 3.速率散射比浊试验 所谓“速率”是指单位时间内抗原与抗体反应的速度或免疫 复合物形成的量 ， 而不是免疫复合物累积产生的量 。
抗原与抗体混合后瞬间即发生反应 ， 在抗体过量的情况下 ，抗原抗体反应速度由慢到快 ， 在单位时间内产生的免疫复合物不断 增多 ， 随后逐渐减慢 ， 在此变化过程中 ， 在某一时间点抗原抗体反 应速率最快 ， 单位时间内产生的免疫复合物含量达到最大值 ， 散射 光强度变化亦最大 ， 此即为速率峰 。
速率峰速率峰的峰值与抗原浓度成正 相关 。
选取速率最大 ，。

10、且与被测抗原浓度变化呈线性关系的速率峰 值 ， 制作剂量剂量- -反应反应曲线 ， 即可计算出被测抗原的浓度 。
速率散射比浊试验具有速度快、灵敏度和精密度高、特异性 强、稳定性好、检测范围宽、自动化程度高、节省试剂等优点；但 仪器试剂比较贵、对抗体的质量要求较高 。
第二节第二节 液相免疫沉淀试验液相免疫沉淀试验 （三）胶乳增强免疫浊度测定 将抗体吸附在大小合适、均匀一致的胶乳颗粒上 ， 当 遇到相应抗原时 ， 使胶乳颗粒发生凝集 。
单个胶乳颗粒在 入射光波长范围内不阻碍光线透过 ， 两个或两个以上胶乳 颗粒凝聚时透射光减少 ， 减少的程度与胶乳颗粒凝聚程度 成正比 ， 同时与待测抗原含量成正比与待测抗原含量成正比 。
通过检测 。

11、光强度变 化即可计算出待测样品中抗原的含量 。
第二节第二节 液相免疫沉淀试验液相免疫沉淀试验 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 一 二 三免疫电泳技术 双向免疫扩散试验 单向免疫扩散试验 凝胶凝胶内沉淀试验（内沉淀试验（gel phase precipitationgel phase precipitation） 利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散 ， 形成浓度 梯度 ， 在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼 可见的沉淀线或沉淀环 。
凝胶内沉淀试验可分为：单向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 一、单向免疫扩散试验 单向免疫扩散试验：先将一定 。

12、量的抗体混于琼脂凝胶 中 ， 使待测的抗原溶液在琼脂内由局部向周围自由扩散 ，在一定区域内形成可见的沉淀环 ， 环的直径或面积的大小环的直径或面积的大小 与抗原含量呈正相关与抗原含量呈正相关 。
根据试验形式可分为试管法和平板法两种 ， 试 管法因沉淀环不易观察及定量 ， 目前较少应用 。
第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 一、单向免疫扩散试验（平板法） 倾注平板倾注平板打孔打孔加样加样放置放置372448h观察沉淀环观察沉淀环 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 一、单向免疫扩散试验（平板法） 抗原量与环直径关系的两种计算方法 1.Mancini曲线：曲线： 大分子抗原（大分子抗原（IgM）。

13、长时间扩散长时间扩散48h 常数常数KCd2 普通坐标纸曲线普通坐标纸曲线 （C为抗原浓度 ， 为抗原浓度 ， d为为 沉淀环直径）沉淀环直径） 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 2.Fahey曲线：曲线： 小分子抗（小分子抗（IgG,IgA） 扩散时间较短扩散时间较短24h 常数常数KlogCd 半对数坐标纸曲线半对数坐标纸曲线 （C为抗原浓度 ， 为抗原浓度 ， d 为沉淀环直径为沉淀环直径) 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 一、单向免疫扩散试验（平板法） 抗原量与环直径关系的两种计算方法 二、双向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验 将抗原和抗体加在同一琼脂板对应孔中 ， 各自向对方 扩散 ，。

14、在浓度比例恰当处形成沉淀线 ， 观察沉淀线的位置 、形状及对比关系 ， 可对抗原或抗体进行定性分析 。
根据试验形式可分为试管法和平板法 。
第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 二、双向免疫扩散试验（平板法） 平板法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法平板法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法 之一 。
之一 。
基本步骤是：打孔在各对应孔中加入抗原或抗 体湿盒3718h24h观察沉淀线 。
第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 二、双向免疫扩散试验（平板法） 应用： 1.判断抗原或抗体的存在以及估计相对含量 2.分析抗原或抗体相对分子量 3.分析抗原的性 。

15、质 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 4.抗体效价的滴定 5.鉴定抗原或抗体纯度 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 三、免疫电泳技术 免疫电泳技术（immunoelectrophoresis technique）是 电泳分析与免疫沉淀试验相结合的产物 ， 是直流电场作用下的 凝胶扩散试验 ， 是将抗原抗体反应的高度特异性与电泳技术的 高分辨率及快速、微量等特性相结合的一种免疫化学技术 。
优点：加快了沉淀反应的速度； 抗原抗体的扩散方向固定集中 ， 提高了灵敏度； 可先利用蛋白组分所带电荷的不同而将其进行 分离 ， 再分别与抗体反应 。
分类：对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固 定电 。

16、泳、交叉免疫电泳和自动化免疫电泳等多项实验技术 。
第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 双向免疫扩散双向免疫扩散+电泳技术电泳技术 （负极） 抗原等电点低 ， 带较 强的负电荷 ， 分子量 小 ， 在电场中向正极 移动 （正极） 抗体等电点偏高 ， 带负电荷 较少 ， 且分子量较大 ， 在电 渗作用下 ， 抗体移向负极 抗原抗体浓度最适比处形成沉淀线 比双向免疫扩散法灵敏度提高8倍16倍 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 （一）对流免疫电泳 原理： （一）对流免疫电泳 结果分析： 1. 无沉淀线出现说 明无相应的抗原 2. 沉淀线出现于抗 原抗体孔中间 ， 说明两者 比例适合 3. 沉淀线接近抗原 孔 ， 表明抗 。

17、体浓度抗原， 反之 ， 则是抗体浓度 抗原浓度 对流免疫电泳结果图 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 （二）火箭免疫电泳 单向免疫扩散与电泳相结合的定量检测技术 原理： 将抗体混合于琼脂中 ， 电泳时 ， 抗体不移动 ， 抗 原由负极向正极泳动 ， 并随抗原浓度的减少 ， 抗原泳 动的基底区也逐渐变窄 ， 抗原抗体免疫复合物形成的 沉淀线也越来越窄 ， 形成一个火箭状的不溶性复合物 沉淀峰。
当琼脂中的抗体浓度保持不变时 ， 沉淀峰 的高度与抗原量呈正比例关系 ， 用已知浓度标准抗原 作对照 ， 制作标准曲线 ， 即可根据沉淀峰的高度从标 准曲线中计算出待测抗原的浓度 。
反之 ， 固定抗原的 浓度 ， 便可检测抗体的含量（称为反向火箭电泳） 。

18、 。
第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 （二）火箭免疫电泳 结果判断： 抗体浓度不变沉淀峰高度与抗原量呈正相关 抗原浓度不变沉淀峰高度与抗体量呈正相关（反 向火箭电泳） 绘制标准曲线 ， 就可根据沉淀峰的高度在标准曲线 中计算出待测样品浓度 。
第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 （二）火箭免疫电泳 为标准抗原；为标本 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 （三）免疫电泳 区带电泳双向扩散 基本原理： 先将蛋白质抗原在凝胶中作区带电泳 ， 根据其所带 电荷、分子量和构型不同分成不可见的若干区带 ， 然后， 沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽 ， 加入相应抗血清， 进行双向扩散 ， 两者比例适合处形 。

19、成弧形沉淀线 。
通 过对沉淀线的数量、位置和形态与已知标准抗原抗体生 成的沉淀线比较 ， 即可对待测样品中所含成分的种类和 性质进行分析 。
应用： 分析纯化抗原和抗体的成分 。
正常异常免疫球蛋白的识别与鉴定 。
第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 免疫电泳流程图 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 （三）免疫电泳 免疫电泳结果示意图 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 （四）免疫固定电泳 区带电泳+沉淀反应 原理： 先将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上经区带电泳分 离 ， 再将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清加在凝 胶表面的泳道上 ， 经孵育后 ， 固定剂和抗血清在凝胶内 渗透并扩散 ， 抗原抗 。

20、体直接发生沉淀反应 ， 洗脱游离的 抗体 ， 形成的抗原抗体复合物则保留在凝胶中 。
经漂洗 和染色 ， 参考泳道和抗原抗体沉淀区带被着色 ， 根据电 泳移动距离分离单克隆组分 ， 可对各类免疫球蛋白及其 轻链进行分型 。
最大的优势：分辨率强 ， 敏感度高 ， 操作周期短 ，结果易分析 。
第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 （四）免疫固定电泳 左图为IgG 型 ， 中图为IgG 型 ， 右为正常 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 （四）免疫固定电泳 应用： 用于鉴定迁移率相近的蛋白和M蛋白 ， 免疫球蛋白轻 链 ， 尿液、脑脊液等微量蛋白 ， 游离轻链 ， 补体裂解产物 等 ， 目前已作为常规检测 。
临床最常用于M蛋白的鉴定 。
第三节 。

21、第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 （五）交叉免疫电泳 区带电泳+火箭免疫电泳 定量检测技术 应用： 适用于比较各种蛋白组分 ， 定性分析蛋白质遗传 多态性、微小异质性、裂解产物和不正常片段等 。
第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 （六）自动化免疫电泳 电泳系统 （自动化电泳仪） 光密度扫描系统 + 优点：分辨率高、重复性好 第三节第三节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验 第四节第四节 免疫沉淀试验的临床应用免疫沉淀试验的临床应用 1.经典的沉淀反应均可用于抗原抗体性质、效价、纯 度及相对分子质量和浓度的分析 2.免疫浊度法目前主要用于蛋白质的测定 ， 如血液中 的免疫球蛋白IgG、IgA、Ig 。

22、M、轻链、轻链 ， 补体C3 、C4 ， 血浆蛋白 ， C-反应蛋白 ， 类风湿因子等；尿及脑脊 液微量蛋白和半抗原（激素、毒物、治疗性药物等；还可 用于血浆药物浓度的测定 第四节第四节 免疫沉淀试验的临床应用免疫沉淀试验的临床应用 3.对流免疫电泳与火箭免疫电泳技术因存在电渗作用， 目前已不推荐使用 4.免疫电泳扩散时间长 ， 影响因素多 ， 结果较难分析 5.免疫固定电泳技术因分辨力强 ， 敏感度高 ， 结果易 于分析 ， 现常用于鉴定迁移率相近的蛋白和M蛋白 ， 免疫 球蛋白轻链 ， 尿液、脑脊液等微量蛋白 ， 游离轻链 ， 补体 裂解产物等 ， 临床最常用于M蛋白的鉴定与分型 ， 并已列 入临床实验室的常规检测工作 第五节第五节 临床常用免疫沉 。

23、淀试验试剂方法特点临床常用免疫沉淀试验试剂方法特点 一、在全自动生化分析仪中的应用 （一）单试剂单波长法 （二）单试剂双波长法 （三）双试剂单波长法 （四）双试剂双波长法 二、在血液凝固分析仪中的应用 三、在半自动电泳仪中的应用 四、在特种蛋白免疫分析仪中的应用 第六节 影响免疫沉淀试验的主要因素 一 二 反应环境因素 抗原抗体自身因素 一、抗原抗体自身因素 （一）抗原因素 1.抗原的理化性状 参与免疫沉淀试验的抗原必须为 可溶性抗原 ， 否则无法形成肉眼可见的沉淀现象 2.抗原表位与种类 天然抗原常为多价 ， 参与免疫沉 淀试验的抗原表面相同表位越多 ， 越容易与相应抗体相互 交联成立体网格状聚集体 ， 出 。

24、现肉眼可见的沉淀物 第六节 影响免疫沉淀试验的主要因素 （二）抗体因素 1.抗体的来源 家兔等大多数动物的免疫血清较人和 马的免疫血清具有更宽的等价带 ， 与相应可溶性抗原结合 更易出现可见的沉淀物 。
而单克隆抗体一般不适合用于免 疫沉淀试验 ， 大多数情况下都是用多克隆抗体 。
2.抗体的质量 用于免疫沉淀试验的抗体要求高纯度 、高特异性、高效价及高亲和力 。
而当抗体纯度不高、特 异性不好、效价过低或含有交叉反应性抗体时均会影响免 疫沉淀试验的结果 。
3.抗体的初始浓度 免疫浊度测定要求抗体在整个反 应过程中都维持过量 ， 因此 ， 抗体的初始浓度对免疫浊度 测定有很大影响 ， 反应前必须预先设定一个合适的初始浓 度 。

25、 。
第六节第六节 影响免疫沉淀试验的主要因素影响免疫沉淀试验的主要因素 （三）抗原抗体的比例 抗原抗体比例是影响免疫沉淀试验的关键性因素 。
沉 淀物的形成是在抗原抗体比例最适合处 ， 只有抗原抗体比 例适合时才能形成沉淀 ， 否则不能形成沉淀物或产生可溶 性免疫复合物而影响结果准确性 。
第六节第六节 影响免疫沉淀试验的主要因素影响免疫沉淀试验的主要因素 二、反应环境因素 适宜的反应环境如电解质、酸碱度、温度等能促进抗 原抗体分子的紧密接触 ， 促进分子聚合 。
（一）电解质 常用0.85%NaCl溶液或各种缓冲液作为抗原抗体稀释 液和反应液 。
（二）酸碱度 免疫沉淀试验必须在适宜的pH环境中进行 ， 一般在 pH 。

【第6章免疫沉淀试验|第06章 免疫沉淀试验】26、69进行 。
（三）温度 免疫沉淀试验必须在适宜的温度环境中进行 ， 最适温 度为37 。
第六节第六节 影响免疫沉淀试验的主要因素影响免疫沉淀试验的主要因素 参考文献参考文献 1.王兰兰 ， 许化溪. 临床免疫学检验. 第5版. 北京： 人民卫生出版社 ， 2012. 2.王兰兰 ， 吴建民.临床免疫学与检验.北京：人民卫生 出版社 ， 2007. 3.徐顺清 ， 刘衡川.免疫学检验.北京：人民卫生出版社， 2006. 4.毕胜利.临床检验免疫学.北京：高等教育出版社 ，2007. 5.钱国英 ， 陈永富.免疫学.杭州：浙江大学出版社 ，2010. 6.何维.医学免疫学.北京：人民卫生出版社 ， 2010. Thank you ! 。

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标题：第6章免疫沉淀试验|第06章 免疫沉淀试验