1、ICS 11.140.01C 30中华人民共和国医药行业标准YY/T 0616.72020一次性使用医用手套第7部分:抗原性蛋白质含量免疫学测定方法Medical gloves for single usePart 7: Test method for theimmunological measurement of antigenic protein2020-09-27 发布2021-09-01 实施国家药品监督管理局 发布YY/T 0616.72020YY/T 0616的总标题为一次性使用医用手套 ， 由以下部分组成： 一第1部分:生物学评价要求与试验；第2部分:测定货架寿命的要求和试验；一第3 。

2、部分:用仓扪中的成品手套确定实际时间失效n期的方法;
一第4部分:抗穿剌试验方法；一第5部分:杭化学品渗透 持续接触试验方法；一第6部分:抗化疗药物渗透性能评定试验方法；一第7部分:抗原性蛋白质含免疫学测定方法；本部分为YY/T 0616的第7部分 。
本部分按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草 。
请注意本文件的某些内容咐能涉及专利 。
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。
本部分由国家药品监竹管理W提出 ， 本部分由山东省医疗器械产品质M检验中心归口 。
本部分起草单位：山东省医疗器械产品质检验中心、山东大学 。
本部分主要起草人:刘佳、张建、孙晓霞、韩秋菊、盖潇潇、屈秋锦 。
II库七七www.kqq 。

3、w.com提供下载医护人员在工作屮能会接触到一些对健康人群产生危害的化学品.为避免此类危害 ， 医护人员需 要佩敞具备相应防护性能的产品（如医用手套） ， 以达到有效防护的H的 。
医用橡胶手套按原料材质的 不同通常分为天然胶乳手套与合成橡胶手套两大类 。
天然胶乳手套中含有天然胶乳蛋白 ， 能诱发I型 超敏反应 ， 表现为皮肤熥部荨麻疹、过敏性鼻结膜炎和哮喘等症状 。
在天然胶乳来源的产品中存在多种 能够引发（I型）过敏反应的蛋白 。
巾于天然胶乳手套中化学添加剂的干扰 ， 依据GB/T 21870-2008 对天然胶乳产品中的蛋白水平进行定可能产生假阳性结果 ， 此外.产品中天然胶乳蛋白含喆常常低 于标准比色蛋白分析的检测限度 。
。

4、一次性使用医用手套第7部分：抗原性蛋白质含量免疫学测定方法1范围YY/T 0616的本部分规定了一次性使用医用天然胶乳手套中抗原性蛋白质含量的免疫学测定的 试验原理、仪器、试剂和耗材、测定方法和试验报告 。
本部分适用于一次性使用医用天然胶乳手套屮抗原性蛋白质含的定量测定 。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。
凡是注n期的引用文件.仅注日期的版本适用于本文 件 。
凡是不注u期的引用文件.其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 。
GB/T 16886.1医疗器械生物学评价 第I部分：风险管现过程中的评价与试验GB/T 16886.20医疗器械生物学评价第20部分 ， 医疗器械免疫毒理学试 。

5、验原则和方法3术语和定义GB/T 16886.1、GB/T 16886.20界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。
3.1抗体 antibody作为免疫应答的一部分产生的免疫球蛋白.能够与抗原特异性结合 。
3.2抗原 antigen能引起机体产生免疫反应的物质 。
3.3抗 primary antibody在反应体系中最先使用的与抗原特异性结合的抗体 。
3.4二抗 secondary antibody在反应体系中与一抗S链特异性结合的酶结合抗体 。
3.5圭寸闭液 blocking solution用于防止非特异性抗体反应的非反应性蛋白溶液 。
3.6偏差 deviation平均测定值与参考值（JX值）之问的差 。

6、异 。
YY/T 0616.720204缩略语下列缩略语适用于本文件 。
ELISA:酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay)HRP :辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)IRM:工业标准物质(industry reference material)NRL:天然胶乳(natural rubber latex)OD：光密度(optical density)OPI)：邻苯二胺(o-phenylenediamine)PBS：磷酸&缓冲液(phosphate-buffered saline)StAg：抗原标准品(standard ref 。

7、erence antigen)T-PBS:吐温磷酸盐缓冲液(PBS tween)TMB： 3 ， 3 ， 5,5-四甲基联苯胺(3,3 ， 5 ， 5-Tetramethylbenzidine5试验原理本部分是采用天然胶乳（NRL）蛋白特异性抗体测定天然胶乳手套中抗原蛋门含敁的免疫学方法 。
将试验样品和特异性NRL蛋白特异性抗体共同孵育 。
分离剩余的NRL蛋白抗体并将其与预先包被 在同相载体匕的过MNRL蛋白抗原结合.加底物砧色 。
通过底物敁色反应导致颜色变化.测定（）1）值 。
6仪器天平；离心机（离心力n周节为500）和相应离心管；恒温箱；酶标仪（用于96孔微址测定板读数 ，并可选计算机进行数据分析） 。
7试剂和 。

8、耗材7.1试剂7.1.1缓冲液7.1.1.1碳酸盐缓冲液用天平称量并将0.795 g碳酸钠（Na2CO3）、1.465 g碳酸氢钠（NaHC（）3 、0.100 g叠氮化钠 （NaN3）溶于蒸馏水中 ， 定容至500 mLo检查pH并在必要时进行调整 。
注:碳酸盐缓冲液可在（4士3）r储存至少1个月7.1.1.2 PBS 缓冲液用天平称量 5.125 g 磷酸二氢钠（NaHjPO, H2O）.45.000 g 磷酸氢二钠（Na2HP（）： 7H2（）并 溶于1.5 L蒸馏水中.并调整pH至7.4 。
加人175.3 g氯化钠（NaCl）,定容至2 L ， 即为10倍贮存液 。
使用前用蒸馏水将10倍贮存液稀释 。

9、为PBS T.作液 。
27.1.1.3 T-PBS 洗液在1 L PBS工作液中加人0.5 mL吐温20（Tween 20） ， 混匀 。
7.1.2封闭液和抗体稀释液7.1.2.1封闭液含3 g/mL脱脂奶粉的T-PBS.100 mL（用于测定板和稀释板的封闭处理） 。
7.1.2.2稀释液含0.2 g/ml.脱脂奶粉的T-PBS,100 niL（用于抗体稀释和克争抑制步骤中的封闭） 。
7.1.3参考品试剂7.1.3.1 StAg 溶液用蒸馏水制备的浓度为丨mg/mL的NRI.蛋白溶液 。
聚丙烯管分装储存于（_2O 10X? ， 解冻后 储存于（43）X注：市竹StAg标推品溶液吋选IKM-913 。
7.1.3.2 。

10、包被抗原用碳酸盐缓冲液将StAg溶液配制成浓度为3 Mg/mL的溶液 ， 用于包被测定板 。
7.1.3.3参考标准品用稀释液将StAg溶液配制成浓度为2 Mg/ml.的溶液.用于克争抑制 。
为了减少可能的蛋白质损 失 ， 所有涉及含蛋白质溶液的步骤应在聚丙烯管或容器中进行 。
避免使用聚苯乙烯或玻璃容器 。
7.1.4抗体7.1.4.1 抗口J采用市侉的抗NRL抗体IRM-9I4 。
7.1.4.2 二抗辣根过氧化物酶（HRP）结合的抗兔IgG.用于检测固相上NRL蛋白结合一抗 。
推荐用稀释液1 ! 5稀释并分装储存于（_20士 10）1 。
7.1.5底物显色溶液可将邻苯二胺（OPD）和过氧化氢（H;
（）2）用于黄色显色 。

11、反应 。
将市锷OPD片剂溶解于蒸馏水中 ，并按照操作说明加人适M的H2（）2 。
如将10 mg OPI）片剂溶解于10 mL蒸馏水中.并在使用前加人 30 ijlL 30% H2O2 。
注：亦可采用TMB试剂盒显色 。
7.2耗材96孔微足测定板:稀释板 ， 低蛋白结合的9（5孔板用于样品稀释和抗体反应；多通道移液器；ELTSA 3库七七www.kqqw.com提供下载YY/T 0616.72020板密封带或塑料盖子 。
8测定方法8.1样品制备8.1.1宜使用7.1.1.2的PBS .T_作液为浸提液 。
8.1.2称逋天然胶乳手套.并记录质M及表面积；每克天然胶乳手套宜加人5 mL的浸提介质 。
S提温 度为（25 。

12、S）X?;
浸提时间为（120士 5）min 。
浸提过程应持续搅动 ， 以确保样品与浸提介质允分接触 。
或在S提过程的开始、中间和结束阶段分别振荡3次隔15 s/次 。
8.1.3取出S提液至聚丙烯管中 ， 置人离心机内离心15 min（离心力5OOg ）,弃去颗粒等沉淀；或通过 低蛋白结合的0.45滤器过滤收集浸提液至聚丙烯竹中 。
注1：在聚丙烯容器中进行浸提 ， 以减少由于吸附到容器销内表而而损失蛋A质的可能.注2: - 般可立即使用所得浸提液 ， 但坷在（4士3T:下储存至多2 d.8.2试验步骤8.2.1稀释板的封闭向96孔稀释板每孔加人300封闭液.（43）t孵育过夜 。
8.2.2测定板的包被向96孔测定板每孔 。

13、加人100 包被抗原（StAg.3 fzg/mL）,用ELISA板密封带或塑料盖子封板 ，（37士 1）C孵育（120士5）min 。
用丁-PBS洗板I次 ， 弃去上清 。
或在（4士3/C包被抗原过夜 ， 并在后续 试验开始前T-PBS洗板1次 。
每孔加入300 ML封闭液并封板 ， （371C于fr:温箱内孵育1 h 。
8.2.3抑制步骤8.2.3.1在96孔稀释板中 ， 用T-PBS洗板2次；如表1所示 ， 除A行外.每孔加人100 稀释缓冲液； 向A行中A1和A2孔各加人200 pL抗原标准品（StAg,2 pg/mL）,向A3至A12孔各加人200 fzL待 测样品（每个样品至少2复孔）；通过从A行取100 zH 。

14、、/孔至B行各孔 ， 再从B行依次至G行 ， 将抗原标 准品或待测样品进行7个系列梯度稀释（每次通过t下吸液5次来混匀.最后在G行混匀后弃去 100 ML/孔）；H行为无抑制行 ， 其各孔含100 ixl.稀释液 。
注：毎个待测样品_）+有3个稀释倍数（至少W有2个稀释倍数） ， 且每1稀释倍数W有2个重g 。
8.2.3.2准备适宜稀释度的一抗 ， 使“无抑制孔的最大（）1）值为0.82.0 。
根据表1所示 ， 加入一抗 100 pd、/孔 ， 无一抗的对照孔则加人100 mL稀释液 ， 使最终齐孔体积均为200 ;
zL 。
封板 ， （37l）t孵 育（120士 5） min 。
#库七七www.kqqw.com提供下载YY/T 0616 。

15、.72020表1抑制步骤中96孔稀释板操作举例序号123456789101112AStAg2 fxg/mL浸提液11 : 1浸提液2 1 : 1浸提液3 1 : 1浸提液41 s 1浸提液51 1BStAg1 Mg/mL浸提液11 ： 2浸提液21 ： 2浸提液31 : 2浸提液41 2浸提液51 ： 2CStAg0.5 pg/mL浸提液11 : 4浸提液21 ： 4浸提液3 1 : 4浸提液41 : 4浸提液51 : 4DStAg0.25 pg/mL浸提液11 : 8浸提液21 8浸提液31 - 8浸提液41 8浸提液51 8EStAg0.125 jug/mL浸提液11 : 16浸提液21。

16、s 16浸提液31 * 16浸提液41 : 16浸提液51 : 16FStAg0.063 pg/mL浸提液11 * 32浸提液21 * 32浸提液31 : 32浸提液41 ： 32浸提液51 : 32GStAg0.031 fig/ mL浸提液I1 : 64浸提液21 : 64浸提液31 : 64浸提液41 : 64浸提液51 : 648.2.4将样品加至测定板在96孔测定板屮.用T-PBS洗板2次 。
在加人抑制混合物之前 ， 应确保尽讨能弃除测定板中残留 液体且该板未干燥 。
从抑制步骤所用的稀释板中取出100 pL/孔加至测定板 。
封板.（37士 1TC孵育 （120 士 5）min 。
8.2.5与二抗（ 。

17、HRI结合的抗兔IgG）孵育在96孔测定板中 ， 用T-PBS洗板3次 。
除了“无二抗”组加人100 ML/孔稀释液 ， 其余各孔加人100适当稀释的二抗 ， （371） X?孵育（605） min 。
8.2.6底物反应与光度计读数在96孔测定板中 ， 用T-PBS洗板3次 。
加入100 ML/孔底物it色液 ， 室温孵育5 min30 min ， 注 意终检测的（）1）值不宜超过2.0 。
用终止液D（H2S（）4） = 2 mol/h硫酸溶液终止i色反应 。
宜在加 人终止液5 min后 ， 用酶标仪在450 nm检测波长下读数 。
注：T-PBS洗液温度可能影响EI.ISA检测并出现“边缘效应” ， 即板周边孔的（）D值始终离于或低于内 。

18、部ffig孔 。
对于这些结果的可能的解释是.如果在室温下洗板.然后将其畀于较温度如37 *的孵粕中.则微孔板的冷热 不均 。
川以通过确保洗液的温度hi孵旮的温度相同.来减少温度分布不均匀的影响.8.3结果计算将标准品的平均吸光度值减去本底吸光度值（无二抗）并与标准品浓度绘制拟合曲线 。
相关系数（r 宜不小于0.96 。
待测样品应至少有2个稀释度的吸光度值在试验设置的标准品读数范围内 ， 宜在 40%65%的抑制率之间 。
取至少2个抑制率40%65%的待测样品的吸光度（推荐3个稀释度） ， 将 其代入标准曲线.计算相应NRL蛋白浓度.取其平均值作为待测样品浸提液中所含NRL蛋白浓度 5库七七www.kqqw.c 。

【YY∕T|YY∕T 0616.7-2020 一次性使用医用手套 第7部分：抗原性蛋白质含量免疫学测定方法】19、om提供下载YY/T 0616.72020（Mg/mL） 。
将浸提液中测定的蛋白浓度转化为手套蛋白含tf ， 单位为微克每克（Mg/g） 。
注1：由于测试的抗原水平是由测试方法专门定义的.该测试方法不存在参考.W此不能确定偏差 。
注2:物质如洗涤剂或表面活性剂具有防止抗体与抗原结合的可能 ， 并可能T扰ELISA测定 。
然而 ， 由于ELISA 检测的敏感性.这些干扰常常付以通过连续稀释样品来控制 。
9试验报告试验报告中宜至少包含下列信息：a）试验样品名称、规格沏号和批号；b）试验样品制备方法；c）试验条件和试验步骤；d）试验结果；e）结论 。
参考文献改进Lowry法1 GB/T 21870-2008天然胶乳医用手套水抽提蛋白质的测定库七七www.kqqw.com提供下载 。

来源：(未知)

【学习资料】网址：/a/2021/0319/0021725910.html

标题：YY∕T|YY∕T 0616.7-2020 一次性使用医用手套 第7部分：抗原性蛋白质含量免疫学测定方法