E1: 细菌荧光素酶 ， 由、 。

13、 2 个亚基组成 ，为40000-42000D ，为37000-39000D 。
单独、 亚基均无发光活性 ， 只有、 共存时才有活性 。
E2: NADH：FMN 氧化还原酶 ， 分子量为3000D ， 对FMN 有高度特异性 。
E3: 脂肪酸还原酶 。
四、实验仪器与材料1. 试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水 。
氯化钠溶液 ， 2.0 g/100 ml (3.0 g/100 ml) ， 称取2.0 g (3.0 g)氯化钠溶于100ml 蒸馏水中 ， 置于2-5冰箱备用 。
氯化汞母液 ， 2 000 mg/L ， 万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞0.1000 g 于50 ml 容量瓶中 ， 用3.0 g/100 。

14、ml 氯化钠溶液稀释至刻度 ， 置于2-5冰箱备用 ， 保存期6 个月 。
氯化汞工作液 ， 2.0 mg/L ， 用移液管吸取氯化汞母液10 ml 入1000 ml 容量瓶 ， 用3.0g/100ml 氯化钠溶液定容 。
再用移液管吸取氯化汞20 mg/L 液25 ml 入250 ml 容量瓶 ， 用3.0 g/100 ml 氯化钠溶液定容 ， 将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶 ， 然后 ， 用3.0 g/100 ml氯化钠溶液将氯化汞2.0 mg/L 溶液按表1 稀释成系列浓度(稀释至50 ml 容量瓶中) 。
配制的稀释液保存期不超过24 小时 。
2. 明亮发光杆菌T3 小种 (Photobacterium phosphoreum T 。

15、3 spp.)冻干粉 ， 安培瓶包装 ， 在2-5冰箱内有效保存期为6 个月 。
新制备的发光细菌休眠细胞(冻干粉)密度不低于每克800万个细胞；冻干粉复苏2 min 后即发光 ， 可在暗室内检验 ， 肉眼可见微光 ， 稀释成工作液后 ， 经稀释平板法测定 ， 每毫升菌液不低于1.6 万个细胞(5 毫升测试管)或2 万个细胞(2 毫升测试管) 。
在DXY-2 型毒性测试仪上测出的初始发光量应在600-1900 mV之间 ， 低于600 mV 允许将倍率调至“X2”档 ， 高于1900 mV 允许将倍率调至“X0.5”档 。
仍达不到标准者 ，更换冻干粉 。
发光细菌的毒性实验在美国Maxwell（MSI.） LuminMax-C 冷光仪完成 。
。

16、发光细菌的复苏：从冰箱内取出含有0.5 g 发光细菌冻干粉和氯化钠溶液 ， 置于含有冰块的小号保温瓶 ， 用1 ml 注射器吸取0.5 ml 冷的氯化钠2.0 g/100 ml 溶液(适用于5ml 的测试管)或1 ml 冷的氯化钠2.5溶液(适用于2 ml 的测试管)注入冻干粉中 ， 充分混匀 。
2 min 后菌即复苏发光 ， 可在暗室观察 ， 肉眼可见微光 。
备用 。
发光细菌的培养：(1) 培养液：酵母浸出汁5.0g ， 胰蛋白胨5.0g ， NaCl 30.0g ， NaHPO4 5.0g ， KH2PO4 1.0g ， 甘油3.0g ， 加蒸馏水至1000ml,pH 调至70.5 ， 趁热分装于150ml 三角瓶中 ， 每瓶约50ml ， 塞上棉球 。

17、 ， 用牛皮纸包扎好 ， 经115、20-30min 高压蒸汽灭菌后置于4左右冰箱中备用 。
(2) 固体培养基：取上述培养液100ml ， 加入1.5-2g 琼脂粉 ， 电炉加热使溶解至透明 ， 调节pH 值为70.5 ， 趁热用漏斗分装于试管中 ， 每支试管各约10ml ， 塞上棉球 ， 用牛皮纸包扎好 ， 经121高压灭菌20-30min 后 ， 取出制成斜面 。
(3) 斜面菌种培养：将发光菌冻干粉用0.5ml 3%NaCl 溶解 ， 迅速转入50ml 培养液中 ， 20恒温培养 ， 每24h后转接一次斜面 ， 将培养好的第三代斜面置4冰箱中备用 。
(4) 摇瓶菌液培养：将培养好的第三代新鲜斜面菌种T3 接入装有50ml 培养液的150ml 锥形瓶中 ， 接 。

18、种量不得超过一接种环 ， 于20振荡(180r/min)培养12h(即对数生长期)后备用 。
(5) 工作菌液培养：吸取一定量刚培养好的摇瓶菌液 ， 用3%的NaCl 溶液稀释并磁力搅拌均匀 。
控制对照(2.0ml 3%NaCl 溶液+0.1ml 工作菌液)发光强度300mv-900mv 。
3. 仪器：生物发光光度计 ， 配制2 或5 ml 测试管 ， 当氯化汞标准液浓度为0.10 mg/L 时 ， 发光细菌的相对发光度为50 ， 其误差不超过10 。
2 或5 ml 测试样品管 ， 具标准磨口塞 ， 为制造比色管的玻璃料制作 ， 由专业玻璃仪器厂制造 ， 分别适用于相应型号的生物放光光度计 。
注射器(1 ml)、微量注射器(10 l)、定量加液 。

19、瓶(5 ml)、吸管(2、10、25 ml)、试剂瓶(100 ml)、量桶(100、500 ml)、棕色容量瓶(50、250、1000 ml)、半微量滴定管(配磨口试液瓶 ， 全套仪器均为棕色 ， 10 ml)等若干 。
五、测定在预实验的基础上 ， 将待测物配成 5-7 个浓度梯度 ， 各取不同浓度梯度溶液2ml 加入具塞磨口比色管中 ， 取0.2ml 工作菌液与各比色管中 ， 加塞上下振荡摇匀 ， 去塞 ， 暴露15min ， 以2ml3%的NaCl 溶液做空白对照 。
测发光强度 。
每个浓度梯度设3 组平行 。
六、实验结果受试化合物的毒性作用用发光细菌的发光强度相对抑制率表示 。

稿源：(未知)

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标题：环境|环境毒理学实验( 三 )