一个150 bp 。

13、 的 PCR 产物用于测序 ， 去掉两个引物的序列大约40到50 bp，再加上测序起始端的一些读不好的碱基 ， 真正能够得到的有用序列不过几十碱基 。
这只是最理想的假设 ， 这么短片断测序失败的几率非常大 ， 因此只能克隆后再进行测序 。
19 、 我的质粒样品很好 ， 测序结果怎不好?由于原因不明的复杂结构如发卡和回文结构 ， 有时会出现突然信号减弱或消失；有时测序根本不能进行下去 ，DNA 碱基排列并无特别异常 ， 可能是 DNA 整体出现复杂结构 ， 反应无法进行 。
20 、 我的样品还保留了吗?我想现在反向再测一个反应 。
出于保密原则我们测序样品只保留一个月 ， 所以若要再测序 ， 请抓紧时间 ， 否则只有重新送样 。
21 、 已 。

14、经测通了样品 ， 但重叠的地方有错配 ， 是为什么?测通的全序列是拼接后的结果 ， 由于拼接处一般是在一次测序的末端和次个反应开始一段 ， 通常会有一定的杂带 ， 以序列信号好的为主 ， 次的为参考 ， 但也不绝对 。
常见峰图及原因说明(From: HTUTUUUTTH )1.PCR产物电泳检测条带单一 ， 为什么测序结果说模板杂？2. 什么是碱基缺失？3. 什么是引物不纯？4. 重复结构对测序有哪些影响？5. 什么是模板不单一？6. Poly结构的测序结果是怎样的？7. 含有回文结构的模板测序结果是怎样的？8. 测序峰图为前双峰的结果是什么样的？9. 测序峰图为后双峰是什么样的？10. 无信号的结果：信号值(ATGC的平均 。

15、值)皆小于10011. 飘峰：这是由于用3.0特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移12. 没有任何干扰的结果Q-1.PCR产物电泳检测条带单一 ， 为什么测序结果说模板杂？A-1.PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果 。
对于与目的片段条带大小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的 。
但是DNA测序反应敏感而客观 ， 可以直接反应出模板本身的情况 。
需要强调的是 ， 高质量的PCR产物才可能得到高质量的测序结果 ， 如果您对PCR产物的纯度不很确定 ， 希望您可以将PCR产物进行克隆处理 ， 以确保得到好的测序结果 。
以下图为例：该反应的背景信号较高 ， 不利于碱基的判读 。
解决办法：改变PCR条件 ，。

16、重新扩增 。
或者可以将该PCR产物克隆到质粒中 ， 初步筛选后进行单克隆测序 。
Q-2.什么是碱基缺失？A-2.以下图为例：碱基缺失常见在PCR产物中 ， 特别是从基因组中扩增得到的PCR片段 ， 上图的186位缺失两个连续的T解决方法：(1) 使用反向引物继续测序 ， 以矫正缺失位点并达到测通的目的 。
或者将该PCR产物克隆到质粒中 ， 挑取单克隆测序 。
(2) 如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点 ， 那么可以改变PCR反应条件 ， 重新扩增 。
Q-3.什么是引物不纯？A-3.以下图为例：引物不纯造成移码现象 ， 该种现象与模板杂在峰图都表现为背景峰较杂 ， 但是引物不纯在峰图上表现的更有规律 ， 一般在每一个主峰前或者后都有一 。

17、个同一碱基的小峰 。
解决办法：重新合成引物 ， 或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序 。
Q-4.重复结构对测序有哪些影响？A-4.以下图为例：重复结构将导致测序复制框的滑移 ， 重复结构之后峰型混乱 。
解决办法：使用反向引物对模板进行测序 ， 测到该重复结构处 ， 即可完成模板全长的拼接 。
Q-5.什么是模板不单一？A-5.以下图为例：(1) 菌液为非单克隆：下图是pGEM-T载体测序的结果 ， 在83位点处测序结果出现双峰（插入后双峰） ， 即模板中含有两个或两个以上的相同载体 ， 但是插入片段不同 。
解决办法：重新挑取单克隆或者重新提取质粒 。
需要注意的是 ， 重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段 ， 并不足以证明 。

18、模板的单一 。
(2) PCR产物不纯 ， 如下图所示：在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰 ， 且在197bp位置有一个高高的A峰 ， 这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段 。
注：PCR产物测序都是以A高峰终止 。
解决方法：对PCR产物切胶纯化 ， 再进行测序 。
Q-6.Poly结构的测序结果是怎样的？A-6.以下图为例：以polyT为例 ， 在polyA/T结构之后往往出现移码、双峰、套峰现象 ， 而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减或者直接中断 。
解决办法：使用反向引物对模板进行测序 ， 测到该poly结构处 ， 即可完成模板全长的拼接 。

稿源：(未知)

【傻大方】网址：/a/2021/0813/0023655374.html

标题：DNA|DNA测序常见问题及其分析( 三 )