25、些测序引物 ， 我们将按碱基个数收取引物合成费用 。
Q4.为什么我的PCR片段为300bp ， 而你们发送给我的序列却达到了700多bp？答：如果您查看峰图的话 ， 可以在您的PCR序列终止处看到一个高高的A峰 ， 该A峰是您的PCR测序反应的结束标志 ， 在此标志之后的序列是噪音 ， 而不是您的测序结果 。
因为我公司完全忠实于测序结果 ， 不会对测序结果进行人为修改 。
所以在您收到结果时 ， 请结合我们的DNA测序服务报告查看测序峰图 ， 按照您的实验要求对测序结果进行分析 。
Q5. 我的引物做PCR效果很好 ， 为什么用于测序总得不到好的结果？答：用于测序的引物比用作PCR反应的引物要求高 ， 以下是不适合用于测序反应的引物类型：不纯的引物 。

26、：用于测序的引物纯度要求很高 ， 合成中的小片段会直接造成严重的背景峰 。
用于测序的引物序列长度之所以一般在24个碱基之内 ， 就是因为过长的引物纯度不易保证 。
简并引物 ， 随机引物和有特殊标记的引物都不适合DNA测序 。
Q6. 我进行PCR反应时 ， 所用的退火温度是59 ， 是否可以用该温度对我的样品完成测序反应？答：非常抱歉 ， 目前我公司不会单独对客户的测序反应设定特定的条件 ， 全部的测序反应均在统一的条件下完成 。
Q7. 我的PCR扩增产物有多条带 ， 是否可以为我完成切胶纯化 ， 再进行测序反应？哪些情况下需要进行切胶纯化 。
答：目前我公司通常只接收单一条带的PCR产物 ， 一般不提供切胶纯化服务 。
如果老师自己实验室的确无法完 。

27、成切胶工作 ， 在同意交付25元/条带的服务费后 ， 我公司可以提供此项服务 。
PCR产物电泳检测后发现以下情况之一时 ， 建议进行切胶纯化：1） 除主带外 ， 还存在其他条带；2） 引物二聚体在过柱纯化后还大量存在 ， 将影响测序结果；3）体系中盐分在过柱纯化后还影响测序结果 。
Q8. 我的PCR产物为单一条带 ， 但未经纯化 ， 是否可以直接送到贵公司进行测序？答：可以 。
我公司将免费为您进行PCR产物的过柱纯化 ， 目的在于去除PCR反应体系中的大部分小片段、剩余dNTP及大部分的盐分 。
Q9. 我的PCR产物电泳检测条带单一 ， 为什么测序结果说模板杂？答：PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果 。
对于与目的片段条带大小只 。

28、相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的 。
但是DNA测序反应敏感而客观 ， 可以直接反应出模板本身的情况 。
需要强调的是 ， 高质量的PCR产物才可能得到高质量的测序结果 ， 如果您对PCR产物的纯度不很确定 ， 希望您可以将PCR产物进行克隆处理 ， 以确保得到好的测序结果 。
以下图为例：该反应的背景信号较高 ， 不利于碱基的判读 。
解决办法：改变PCR条件 ， 重新扩增 。
或者可以将该PCR产物克隆到质粒中 ， 初步筛选后进行单克隆测序 。
Q10.什么是碱基缺失？答：以下图为例：碱基缺失常见在PCR产物中 ， 特别是从基因组中扩增得到的PCR片段 ， 上图的186位缺失两个连续的T 。
解决方法：1) 使用反向引物继续测序 ， 以 。

29、矫正缺失位点并达到测通的目的 。
或者将该PCR产物克隆到质粒中 ， 挑取单克隆测序；2) 如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点 ， 那么可以改变PCR反应条件 ， 重新扩增 。
Q11.什么是引物不纯？答：以下图为例：引物不纯造成移码现象 ， 该种现象与模板杂在峰图都表现为背景峰较杂 ， 但是引物不纯在峰图上表现的更有规律 ， 一般在每一个主峰前或者后都有一个同一碱基的小峰 。
解决方法：重新合成引物 ， 或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序 。
Q12.重复结构对测序有哪些影响？答：以下图为例：重复结构将导致测序复制框的滑移 ， 重复结构之后峰型混乱 。
解决办法：使用反向引物对模板进行测序 ， 测到该重复结构处 ， 即可完成模板全长的拼 。

30、接 。
Q13.什么是模板不单一？答：以下图为例 ， 下图是pGEM-T载体测序的结果 ， 在83位点处测序结果出现双峰 ， 即模板中含有两个或两个以上的相同载体 ， 但是插入片段不同 。
解决办法：重新挑取单克隆或者重新提取质粒 。
需要注意的是 ， 重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段 ， 并不足以证明模板的单一 。
对于PCR产物也同样有模板不单一的情况 ， 如下图所示：在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰 ， 且在197bp位置有一个高高的A峰 ， 这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段 。

稿源：(未知)

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标题：DNA|DNA测序常见问题及其分析( 五 )