1、TOPO 克隆技术与基因定点突变技术,北京全式金生物技术有限公司 ,背景资料,基因克隆是分子生物学必不可少的工具 ， 传统的T4 DNA Ligase方法实验周期长 。
TOPO克隆5分钟快速克隆 ， 是克隆技术的革命 。
这个技术上的飞跃为实现“加速科研”的理念提供了先决条件 。
基因定点突变技术改造基因的便利方法 。
基因功能研究已经成为生命科学研究的新热点 ， 因此需要强有力的工具保证基因结构和功能关系研究的进行,TOPO克隆技术,TOPO克隆原理 TOPO克隆策略 TOPO克隆成功的关键 TOPO克隆常见问题及解决方法,TOPO克隆原理,TOPO即Topoisomerase 拓扑异构酶 特点： 由316个氨基 。

【topo|topo克隆和点突变ppt课件】2、酸组成 识别5-CCCTT-3 同时具有限制性内切酶和连接酶的功能 不需要能量,TOPO克隆原理,TOPO克隆过程,TOPO克隆过程,TOPO克隆迅速、便捷,TOPO克隆克隆策略,有无杂带？有无引物二聚体,基因克隆、转化,TOPO克隆和传统T4克隆比较,TransGen TOPO Vector,pEASY-T1 Cloning Vetor pEASY-T1 Simple Cloning Vetor pEASY-T3 Cloning Vetor pEASY-Blunt Cloning Vetor pEASY-Blunt Simple Cloning Vetor pEASY-E1 Expressi 。

3、on Vetor pEASY-E2 Expression Vetor,克隆载体图谱TA Cloning,克隆载体图谱Blunt Cloning,表达载体TA Cloning,一步法载体构建藉由TOPO技术实现,TOPO克隆成功的关键,引物设计 PCR条件 克隆反应设置（DNA加入量、反应的温度和时间） 克隆感受态细胞的选择 选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒,引物设计： 引物不能磷酸化； 引物5端第一个碱基会影响下游的连接效率； PCR注意事项： 后延伸设置为721020分钟； 目的： 保证扩增片段完整 ， 可以有效降低扩增背景； 使用Taq系列DNA聚合酶扩增时 ， 该步骤相当于加A反应,目的片段 。

4、加入量为保证良好的连接效率 ， 推荐如下 700bp以及更小的片段：保证20ng 700bp以上的片段：保证30100ng 2Kbp左右的片段：保证40ng 3Kbp左右的片段：保证60ng 片段加入量max：4l ， 浓度很低时也有一定的连接效率 ，体积大于5 l会破坏反应体系平衡； 片段加入量min：0.5l ， 浓度很高时需要稀释 ，可以补充无菌水方便操作 。
反应温度： TOPO酶的工作温度为2037,反应时间,克隆感受态细胞的选择,选择质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒： 试剂品质很关键 质量不好的试剂盒很可能会抑制下游连接,TOPO克隆常见问题及解决方法,克隆数少（确认感受态细胞效率正常时） 克隆 。

5、阳性率低 PCR鉴定重组子失败 菌落多为淡蓝色或FishEye（白边蓝芯,克隆数少或阳性率低,上述五种情况 ， 均需要适当延长连接反应时间！以保证连接效率和克隆数 。
（可参考上文的载体连接反应时间） 另外每种情况也有一些特别的地方可以改进 ， 进一步提高克隆效果,PCR产物不新鲜： Why 3端热力学不稳定 ， 3“A”容易脱落 直接导致TA克隆效率低 How PCR产物置于4保存12天内使用 不要冷冻PCR产物 PCR结束后立即使用效果最好,克隆胶回收片段： Why 紫外照射和EB对dsDNA造成损伤； (受到损伤的DNA不是连接的最佳底物) 3-“A”容易在电泳过程中被核酸外切酶降解 ， 导致TA连接效率低 。

6、； 试剂残留的抑制 。
How 操作中通过细节注意避免,目的片段浓度很低： Why 无法保证有效碰撞 How 浓缩DNA,毒基因： Why其本底表达产物对宿主生长有明显抑制 How 选用Top10,基因特殊结构： Why 具有高AT、高GC、反向重复序列的基因 ， 不容易连接 How 调整、摸索连接体系和条件 尝试不同的载体 ， 不同的骨架对片段偏好性不同,PCR鉴定重组子失败： 现象：用通用引物鉴定时 ， 扩增产物既无目的带又无载体自连带 How 预变性95 10min （彻底裂解菌体、释放DNA） 最好能用通用引物鉴定,菌落多为淡蓝色或FishEye： Why 插入片段没有影响LacZ基因读码框 插入片 。

7、段小（小于400bp） How 不要丢弃平板！ 进行进一步鉴定,基因定点突变技术,利用PCR实现点突变的几种传统方法 GeneTailor ， QuickChange ，Easy /Fast Mutagenesis System 三种市售点突变试剂盒的比较,传统方法：仅利用PCR,反向PCR定点突变 重叠延伸PCR定点突变 大引物PCR定点突变,反向PCR： 特点： 必须以质粒为模板； 引物方向相反； 引物需要磷酸化,重叠延伸PCR： 特点：两轮PCR,大引物PCR： 特点：两轮PCR,GeneTailor ， QuickChange ， Easy/Fast Mutagenesis System也是基于P 。

8、CR原理实现点突变 ， 但它们与传统方法的区别主要在于可以对突变克隆进行初步的筛选 筛选原理：降解甲基化质粒模板 筛选依据： 来自大肠杆菌的质粒99%发生甲基化； PCR是去甲基化过程 ， PCR产物（发生突变的产物）是去甲基化的产物,筛选方法： 体内降解：原始质粒模板可以被能降解甲基化质粒的大肠杆菌（DMT）降解 ， 而去甲基化的扩增产物（发生突变的产物）不会被降解 。

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