傻大方摘要：【实验|实验6+DNA酶切、连接及电泳检测( 三 )|DNA|酶切|连接|电泳|检测】粘性末端和平头末端 。 如如: EcoRI的识别顺序为：的识别顺序为： 5 G A A T T C 3 3.C T T A A G 5 回文结构的对称轴回文结构的对称轴 限制性内切酶的活性以酶...

粘性末端和平头末端 。
如如: EcoRI的识别顺序为：的识别顺序为： 5 G A A T T C 3 3.C T T A A G 5 回文结构的对称轴回文结构的对称轴 限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示 ， 限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示 ， 1 1个酶单位个酶单位 （1 Unit1 Unit）指的是在指定缓冲液中 ， 指的是在指定缓冲液中 ， 3737下反应下反应60min,60min,完完 全酶切全酶切1g1g的纯 。

15、的纯DNADNA所用的酶量 。
所用的酶量 。
影响酶切的因素：影响酶切的因素：在酶切反应中 ， 在酶切反应中 ， DNADNA的纯度、缓冲液的纯度、缓冲液 中的离子强度、中的离子强度、Mg2+Mg2+等因素均可影响反应 ， 一般可通过增等因素均可影响反应 ， 一般可通过增 加酶的用量 ， 延长反应时间等措施以达到加酶的用量 ， 延长反应时间等措施以达到完全酶切完全酶切 。
但应 。
但应 该注意的是 ， 过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异该注意的是 ， 过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异 性的酶切性的酶切( (星号活性星号活性) ) 。
图图: :构建构建DNADNA重组子重组子 材料、试剂及器具材料、试剂及器具 1 1、材料与试剂 。

16、、材料与试剂 酶切反应：酶切反应： p标准标准pUC19(2686bp) pUC19(2686bp) pEcoREcoR及其配套的酶切缓冲液及其配套的酶切缓冲液 检测：检测： p0.50.5TBETBE电泳缓冲液电泳缓冲液 p6 6电泳载样缓冲液电泳载样缓冲液 、GoldviewGoldview、琼脂糖、琼脂糖 2 2 、器具：、器具： p水平式电泳装置水平式电泳装置 p电泳仪电泳仪, ,台式高速离心机台式高速离心机 p恒温水浴锅（用恒温水浴锅（用PCRPCR仪代理）仪代理） p微量移液枪微量移液枪 p微波炉或电炉微波炉或电炉 p紫外透射仪紫外透射仪 p照相机及其附件照相机及其附件 实实 验验 。

17、 步步 骤骤 （一）质粒（一）质粒DNADNA酶切酶切( (注：每人一管）注：每人一管） 在在200l 200l 的薄壁离心管中 ， 按照下表加入试剂（单位：的薄壁离心管中 ， 按照下表加入试剂（单位：ll） 混匀；点动离心将反应液甩至管底 。
混匀；点动离心将反应液甩至管底 。
37(PCR37(PCR仪仪) )保温保温1-2h1-2h进行酶切反应 。
进行酶切反应 。
反应结束后 ， 反应结束后 ，75 75 ， 保温 ， 保温10min10min使酶失活 。
使酶失活 。
电泳检测电泳检测 样品代号样品代号成份成份 反应反应1（标准（标准pUC19) 无菌水无菌水( (l)l)2 P P质粒质粒( (l)l)6 H H酶切缓冲 。

18、液酶切缓冲液( (l)l)1 EEcoRIEcoRI酶酶( (l)l)1.0 Total(Total(l)l)10 （三）质粒酶切样品、（三）质粒酶切样品、DNADNA连接样品的电泳检测连接样品的电泳检测 琼脂糖凝胶的制备：制备琼脂糖凝胶的制备：制备2 2块块0.7%0.7% （0.28g/40ml)0.28g/40ml) （四）加样及电泳检测（四）加样及电泳检测 1 1、酶切样品的检测、酶切样品的检测 p酶切阴性对照（酶切阴性对照（M1M1）：）：pUC19pUC19标样标样 20l + 20l + 6X6X的的loading buffer loading buffer 4 4ll p酶切样 。

19、品：酶切样品：pUC19pUC19酶切样品酶切样品 20l+ 20l+ 6X6X的的loading buffer loading buffer 3 3ll (1) DNADNA连接酶连接酶是是19671967年在三个实验室同时发现的年在三个实验室同时发现的。
它是一种 。
它是一种封闭封闭DNADNA链上缺口酶链上缺口酶 ， 借助 ， 借助ATPATP或或 NADNAD水解提供的能量催化水解提供的能量催化DNADNA链的链的5-PO45-PO4与另一与另一 DNADNA链的链的3-OH3-OH生成生成磷酸二酯键磷酸二酯键 。
但这两条链必 。
但这两条链必 须是与同一条互补链配对结合的须是与同一条互补链配对结合的 。

20、(T4DNA(T4DNA连接酶连接酶 除外除外) ) ， 而且必须是两条紧邻 ， 而且必须是两条紧邻DNADNA链才能被链才能被DNADNA 连接酶催化成磷酸二酯键 。
连接酶催化成磷酸二酯键 。
常用的常用的DNADNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNADNA 连接酶连接酶和来自和来自噬菌体的噬菌体的T4DNAT4DNA连接酶连接酶 。
二者的 。
二者的 作用机理类似 。
作用机理类似 。
实实 验验 原原 理理 连接连接 核酸片段可以通过核酸片段可以通过连接酶连接酶的作用的作用 连接起来而获得连接起来而获得重组分子重组分子 。
DNA连接酶催化双链连接酶催化双链DNA分子中分子中 相邻碱基 。

21、的相邻碱基的5- PO4末端与末端与3- OH间形成间形成3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键 。
一个一个DNA片段的片段的5-PO4末端与另末端与另 一个一个3-OH末端相互靠近时 ， 末端相互靠近时 ，在在DNA连接酶的作用下 ， 有连接酶的作用下 ， 有 Mg2+, ATP存在的缓冲系统中存在的缓冲系统中 可以被连接起来而形成重组分可以被连接起来而形成重组分 子 。

稿源：(未知)

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标题：实验|实验6+DNA酶切、连接及电泳检测( 三 )