傻大方摘要：【实验|实验6+DNA酶切、连接及电泳检测( 四 )|DNA|酶切|连接|电泳|检测】子 。 DNADNA连接酶作用机制连接酶作用机制 实实 验验 原原 理理 连接连接 酶酶 焦磷酸根焦磷酸根 酶酶-焦磷酸根焦磷酸根 酶酶 l T4 DNA连接酶作用机制：连...

子 。
DNADNA连接酶作用机制连接酶作用机制 实实 验验 原原 理理 连接连接 酶酶 焦磷酸根焦磷酸根 酶酶-焦磷酸根焦磷酸根 酶酶 l T4 DNA连接酶作用机制：连接酶作用机制： T4 DNA连接酶作用分三步：连接酶作用分三步： (1) T4 。

22、 DNA连接酶与辅助因子连接酶与辅助因子ATP形成形成酶酶AMP复复 合物合物 。
(2) 酶酶AMP复合物结合到具有复合物结合到具有5磷酸基和磷酸基和3羟羟 基切口的基切口的DNA上 ， 使上 ， 使DNA腺苷化腺苷化 。
(3) 产生一个产生一个新的磷酸二酯键新的磷酸二酯键 ， 把缺口封起来 ， 把缺口封起来. 常用的常用的DNADNA连接酶是连接酶是T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 ， 其作用底 ， 其作用底 物是双链的物是双链的DNADNA分子或分子或RNARNA：DNADNA杂交分子 ， 杂交分子 ，可以连接粘性末端、平末端 。
可以连接粘性末端、平末端 。
T4 DNAT4 DNA连接酶的活性用连接酶的活性用Wei 。

23、ssWeiss单位表示 。
单位表示 。
1 Weiss1 Weiss单位是指在单位是指在3737下下20min20min内催化内催化1nmol 1nmol 3232P P从焦磷酸根置换到 从焦磷酸根置换到 ,-,-32 32P ATP P ATP所所 需的酶量 。
需的酶量 。
l T T4 4DNADNA连接酶的最适反应温度为连接酶的最适反应温度为 ， 为什么实 ， 为什么实 验中采用验中采用1414？ 1.1.粘性末端形成的氢键在低温下更稳定；粘性末端形成的氢键在低温下更稳定； 2.2. 连接反应时间长 ， 低温下酶不容易失活连接反应时间长 ， 低温下酶不容易失活 材料、试剂及器具材料、试剂及器具 1 1、材料与试 。

24、剂、材料与试剂 连接反应：连接反应： pDNA/EcoT14 I : :由由1111条条DNADNA片段组成：片段组成： 1932919329、77437743、6223bp6223bp、42544254、34723472、 2690 2690、18821882、14891489、925925、421421、74 bp74 bp pT4 DNAT4 DNA连接酶及其配套的连接酶及其配套的 1010连接缓冲液连接缓冲液 检测：检测： p0.50.5TBETBE电泳缓冲液电泳缓冲液 p6 6电泳载样缓冲液电泳载样缓冲液 、GoldviewGoldview、琼脂糖、琼脂糖 2 2 、器具：、器具：。

25、p水平式电泳装置水平式电泳装置 p电泳仪电泳仪, ,台式高速离心机台式高速离心机 p恒温水浴锅（用恒温水浴锅（用PCRPCR仪代理）仪代理） p微量移液枪微量移液枪 p微波炉或电炉微波炉或电炉 p紫外透射仪紫外透射仪 p照相机及其附件照相机及其附件 （一）（一）DNADNA片段的连接片段的连接( (注：每人一管）注：每人一管） 取取200 l200 l的离心管按下表加入试剂 。
的离心管按下表加入试剂 。
混匀后点动离心 ， 将溶液甩至管底混匀后点动离心 ， 将溶液甩至管底 置于已调好温度为置于已调好温度为12-14PCR12-14PCR仪中仪中 保温保温1-2h1-2h后取出后取出 电泳检测电泳检测 样品 。

26、样品 代号代号 成分成分用量（用量（ll） ddHddH2 2O O7.07.0 I IDNA/EcoT14 IDNA/EcoT14 I 片段片段 10.010.0 f f连接缓冲液连接缓冲液2.02.0 T TT4DNAT4DNA连接酶连接酶1.01.0 总体积总体积2020 实实 验验 步步 骤骤 （二）（二）DNADNA连接样品的电泳检测连接样品的电泳检测 琼脂糖凝胶的制备：制备琼脂糖凝胶的制备：制备2 2块块1.2%1.2%琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（0.48g/40ml0.48g/40ml） 。
） 。
（三）加样及电泳检测（三）加样及电泳检测 连接样品检测：连接样品检测： p/EcoT14。

27、I /EcoT14 I 样品样品 5l5l（M2M2） pDNADNA连接样品：连接样品：20 l l 恒压电泳恒压电泳: 130V : 130V 电泳至溴酚蓝离凝胶外端电泳至溴酚蓝离凝胶外端1-2cm1-2cm处 ， 大约处 ， 大约30-4030-40分钟分钟 观察观察: :紫外透射仪下观察电泳结果 ， 并拍照记录 。
紫外透射仪下观察电泳结果 ， 并拍照记录 。
实验预期结果实验预期结果 质粒及酶切样品电泳预期结果质粒及酶切样品电泳预期结果 从左至右：从左至右： 1. /EcoT14 I DNA Marker 2. pUC19质粒质粒 3. pUC19质粒酶切样品质粒酶切样品 1 2 3 质粒不同构型的电泳行 。

28、为质粒不同构型的电泳行为 线型线型 DNA 超螺旋超螺旋 DNA 1 2 3 4 5 6 1：-EcoT14 digest 2,3：连接产物：连接产物 4：pUC19质粒质粒 5,6：酶切产物：酶切产物 DNA片段的连接样品电泳预期结果片段的连接样品电泳预期结果 1： DNA/Eco14酶切片段酶切片段 2-3：DNA/Eco14 酶切片段酶切片段 的连接的连接 产物产物 l 1、连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：、连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20- 100mmol/L的的Tris-HCl ， 较多用 ， 较多用50mmol/L ， pH的范围在的范围在 7.4-7.8 ， 较多用 ，。

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标题：实验|实验6+DNA酶切、连接及电泳检测( 四 )