傻大方摘要：【实验|实验6+DNA酶切、连接及电泳检测|DNA|酶切|连接|电泳|检测】所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状生断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状/超超 螺旋螺旋DNA(cccDNA)；开环；开环DNA(ocDNA）；线形...

1、质粒在正常情况下以共价闭合环状质粒在正常情况下以共价闭合环状cccDNA构型构型(超螺旋超螺旋scDNA)存在存在， 在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因 ， 可能会使 ， 在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因 ， 可能会使DNA链发链发 生断裂 。
所以 ， 多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状生断裂 。
所以 ， 多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状/超超 螺旋螺旋DNA(cccDNA)；开环；开环DNA(ocDNA）；线形）；线形DNA(LDNA) 质粒质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图琼脂糖凝胶电泳模式图 M pUC19 环形质粒环形质粒DNA 超螺旋粒超螺旋粒DNA 实验六实 。

2、验六 DNADNA的酶切、连接及电泳检测的酶切、连接及电泳检测 实实 验验 步步 骤骤 （一）质粒（一）质粒DNADNA酶切酶切( (注：每人一管）注：每人一管） 在在200l 200l 的薄壁离心管中 ， 按照下表加入试剂（单位：的薄壁离心管中 ， 按照下表加入试剂（单位：ll） 混匀；点动离心将反应液甩至管底 。
混匀；点动离心将反应液甩至管底 。
37(PCR37(PCR仪仪) )保温保温1-2h1-2h进行酶切反应 。
进行酶切反应 。
反应结束后 ， 反应结束后 ，75 75 ， 保温 ， 保温10min10min使酶失活 。
使酶失活 。
电泳检测电泳检测 样品代号样品代号成份成份 反应反应1（标准（标准pUC19) d 。

3、dHddH2 2O O无菌水无菌水( (l)l)7 pUC19pUC19质粒质粒( (l)l)10 1010* *H H酶切缓冲液酶切缓冲液( (l)l)2 EEcoRIEcoRI酶酶( (l)l)1.0 Total(Total(l)l)20 酶切酶切 样品代样品代 号号 成份成份 反应（标准反应（标准 pUC19) ddHddH2 2O O无菌水无菌水( (l)l)7 pUC19pUC19质粒质粒( (l)l)10 1010* *H H酶切缓冲液酶切缓冲液( (l)l)2 EEcoRIEcoRI酶酶( (l)l)1.0 Total(Total(l)l)20 （二）（二） DNA DNA片段的 。

4、连接片段的连接( (注：每人一管）注：每人一管） 取取200 l200 l的离心管按下表加入试剂 。
的离心管按下表加入试剂 。
混匀后点动离心 ， 将溶液甩至管底混匀后点动离心 ， 将溶液甩至管底 置于已调好温度为置于已调好温度为12-16PCR12-16PCR仪中仪中 保温保温1-2h1-2h后取出后取出 电泳检测电泳检测 样品代号样品代号成分成分用量（用量（ll） ddHddH2 2O OddHddH2 2O O7.07.0 T14 T14DNA/EcoT14 IDNA/EcoT14 I片段片段10.010.0 10 10* *T4T4连接缓冲液连接缓冲液2.02.0 T4 T4T4DNAT4DNA连 。

5、接酶连接酶1.01.0 总体积总体积2020 连接连接 样品代样品代 号号 成分成分用量（用量（ll） H HddHddH2 2O O7.07.0 T14T14DNA/EcoT14 IDNA/EcoT14 I片段片段10.010.0 BufferBuffer连接缓冲液连接缓冲液2.02.0 T4T4T4DNAT4DNA连接酶连接酶1.01.0 总体积总体积2020 （三）质粒酶切样品和（三）质粒酶切样品和DNADNA连接样品的电泳检测连接样品的电泳检测 琼脂糖凝胶的制备：制备琼脂糖凝胶的制备：制备2 2块块0.7%0.7% （0.28g/40ml0.28g/40ml）和）和2 2块块1.2%1 。

6、.2%琼脂糖琼脂糖 凝胶（凝胶（0.48g/40ml0.48g/40ml） 。
） 。
（注：全班制备（注：全班制备4 4块胶）块胶） 1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立；、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立； 2、了解影响酶切的因素；、了解影响酶切的因素； 3、掌握、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立；连接酶的性质以及连接体系的建立； 4、了解影响连接反应的因素 。
、了解影响连接反应的因素 。
实实 验验 目目 的的 通过通过DNADNA重组技术构建重组技术构建DNADNA重组子重组子 利用利用限制性核酸内切酶切割限制性核酸内切酶切割DNA+利用利用DNA连接酶连连接酶连 接接DNA 。

7、是是DNA重组过程中的关键步骤之一 。
重组过程中的关键步骤之一 。
成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主 细胞进行表达提供了有效的实验材料 。
细胞进行表达提供了有效的实验材料 。
限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现 1965年年Werner Arber第一个第一个描述了限制性内切现象描述了限制性内切现象； Hamilton O. Smith第一个第一个纯化了限制性内切酶纯化了限制性内切酶 ， 并鉴定了 ， 并鉴定了 其性质；其性质； Daniel Nathans用这些酶将用这些酶将SV40病毒的病毒的DNA切割成了特定切割成了特定 的片段 ， 并绘制了的片 。

8、段 ， 并绘制了SV40病毒基因组的病毒基因组的“物理图谱物理图谱” 。
1978年这三人获得了当年的年这三人获得了当年的Nobel奖 。
奖 。

稿源：(未知)

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标题：实验|实验6+DNA酶切、连接及电泳检测